湖南石門雄黃礦區(qū)礦樣中的砷氧化細菌的分離及鑒定

楊宇，白飛，楊莉，許慶，邱冠周

1. 中南大學資源加工與生物工程學院，湖南 長沙，410083；2. 中南大學生物冶金教育部重點實驗室，湖南 長沙，410083

湖南石門雄黃礦區(qū)礦樣中的砷氧化細菌的分離及鑒定

楊宇1,2*，白飛1，楊莉1，許慶1，邱冠周1,2

1. 中南大學資源加工與生物工程學院，湖南 長沙，410083；2. 中南大學生物冶金教育部重點實驗室，湖南 長沙，410083

綠色的生物學方法處理含砷廢水，對于緩解工業(yè)發(fā)展所帶來砷污染問題，提高居民健康生活質量具有重要意義。以湖南石門雄黃礦區(qū)的尾礦池積水（SY）、地下400 m處的礦坑水（NY）和尾礦池底泥表層（XY）3個樣本為研究對象，利用細菌富集和多次傳代的方法，從這3個環(huán)境樣本中獲得可氧化三價砷的3個菌群。在砷質量濃度為l～5 g·L-1的培養(yǎng)基中分別檢測上述3個菌群的耐受能力，發(fā)現(xiàn)在砷質量濃度高達5 g·L-1的條件下，上述菌群均能在2～ 3 d內(nèi)達到109cells·mL-1。利用上述菌群處理l g·L-1亞砷酸鈉溶液，SY、XY和NY菌群可分別在25、20和35 h內(nèi)將三價砷完全氧化，并且使溶液中的總砷質量濃度降低66.7%。進一步對3個菌群進行多次平板分離，利用五價砷和硝酸銀的顏色反應，獲得11株可氧化三價砷的目的菌株。對這些菌株16S rDNA進行NCBI的BLASTN序列比對發(fā)現(xiàn)，菌株SMY24、SMY33、SMY22、SMY32、SMY21和SMY31均屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），菌株SMY104屬于不動桿菌屬（Acinetobacter），菌株SMY17、SMY25、SMY9和SMY1在所有的已知序列中，最大的相似率只有91%，最小的相似率為76%，且都是未曾報道純培養(yǎng)的細菌。對這些菌株三價砷氧化能力進行測定發(fā)現(xiàn)，其中菌株SMY104和SMY21在20 h內(nèi)能將三價砷幾乎完全氧化。通過對這些菌株三價砷氧化酶基因進行初步檢測，發(fā)現(xiàn)了多個菌株具有三價砷氧化酶基因（AoxB）。

湖南石門雄黃礦；三價砷；五價砷；砷氧化菌；三價砷氧化酶基因

砷是人類活動（如：貴金屬采礦、藥品生產(chǎn)、木材加工、玻璃制造工業(yè)以及電子工業(yè)等）（Han等，2003；K?hler等，2011）所產(chǎn)生大量化合物的組成成分之一，而砷在自然界中主要以硫化物的形式存在，如雄黃（As2S2）、雌黃（As2S3）、砷黃鐵礦等（何振立等，1998）。眾所周知，砷是一種非常有害的物質，能夠引起包括癌癥在內(nèi)的多種疾病。世界衛(wèi)生組織（WHO）在1993年所提出的最新飲用水含砷最低質量濃度標準也從1984年的50 μg·L-1降低到10 μg·L-1（世界衛(wèi)生組織，2006）。湖南石門雄黃礦，是有著1500余年歷史的亞洲最大的雄黃礦。它的開采，對當?shù)氐乃春屯寥涝斐闪酥卮笪廴尽４送猓渌恍┯猩饘倭蚧V如砷黃鐵礦和含砷金礦等的冶金過程，均會產(chǎn)生一定的含砷廢水。世界上的許多國家都曾發(fā)生過含砷廢水的不合理處置，導致大面積的砷中毒事件。

目前，水體修復主要采用沉淀法、絮凝法、吸附法、氧化法、離子交換法、膜分離法等方法去除砷，也都取得了較好的效果。由于物理化學方法較高的代價，且容易造成二次污染，因而運用高效綠色的生物方法來處理含砷廢水具有重要意義。微生物對砷的適應性極強，甚至有的微生物以砷作為其生長的能源。微生物參與As（V）和A（III）之間氧化還原過程（Valenzuela等，2009）。As（III）的毒性最強，是As（V）的25～60倍，并且在多數(shù)的環(huán)境條件下較As（V）更難以被礦物質吸附（范成新等，2002）。因此，砷氧化菌在被用于處理富含三價砷的水體中具有潛在的應用價值。已有學者從土壤（宋衛(wèi)鋒等，2011）、沉積物（汪耀等，2010）及活性污泥（王薇等，2006）中分離、鑒定出具有砷氧化功能的菌株。與此同時，從土壤中分離到了氧化率可達99%的砷氧化細菌（莫于婷等，2009）。截止2001年，國外已發(fā)現(xiàn)了至少9個屬的30多個菌株可以氧化砷，主要包括無色桿菌屬（Achromobacter），假單胞菌屬（Pseudomonas），產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes），根瘤菌屬（Rhizobium）等屬，它們大多是異養(yǎng)砷氧化菌（Gihrin等，2001）。目前有關微生物除砷的理論和應用研究還處于起步階段，因而如何運用高效綠色的生物方法來治理含砷廢水還需要大量基礎研究。

本文以湖南石門雄黃礦區(qū)的水樣和泥樣為研究對象，在前期對湖南石門雄黃礦區(qū)環(huán)境樣品的細菌群落結構及其多樣性進行研究（Yang等，2013）的基礎上，從這些環(huán)境樣品中分離、鑒定出多種可氧化三價砷的菌群和菌株及多個三價砷氧化酶基因，并且探討了菌群和菌株對三價砷耐受性和氧化的規(guī)律，為今后開展含砷廢水及土壤的生物修復提供一定的菌種資源及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

湖南石門雄黃礦是已開采了 2000多年的古礦，蘊藏量大、質量好，為我國現(xiàn)有藥用雄黃的主產(chǎn)區(qū)之一。湖南石門雄黃礦位于石門縣城西北界牌峪，直徑 3 km，石（門）清（官渡）公路經(jīng)過礦區(qū)，往東42 km接枝柳鐵路石門站，往北9 km到沿市。采樣區(qū)位于磺廠（圖1）附近，地理坐標為：東經(jīng) 29°38′11"～29°38′43"，北緯 111°2′06"～111°2′23"。本區(qū)地處武陵山脈北西部的低山丘陵區(qū)，山脈近東西走向，地勢西高東低，最高海拔444.5 m，最低161 m，一般相對高差200 m。區(qū)內(nèi)水系發(fā)育，溪流呈梳狀分布，流經(jīng)的小河主要有黃水，向北7 km匯入澧水支流渫水河。本區(qū)屬亞熱帶濕潤季風氣候，全年平均氣溫 16.7 ℃，年降水量1367 mm。居民主要種植水稻，副業(yè)有柑桔、油茶及林業(yè)。

圖1 研究區(qū)位置圖Fig. 1 The location of the research area

1.2 樣品采集

湖南石門雄黃礦的2個水樣樣品（SY和XY）是用滅菌的塑料瓶直接在水面下約0.5 m處采集，蓋上瓶蓋，回實驗室再分別用中速無菌濾紙過濾獲得；雄黃礦的尾礦池底泥樣品（NY）是用采樣器在的表層2 cm處用多點混樣的方法得到，放入封口袋密封。所有樣品做好標簽并4 ℃冰箱儲存待用。

1.3 3個菌群和目的菌株的篩選

采用含20 mg·L-1亞砷酸鈉的CDM培養(yǎng)基（Liao等，2011）的250 mL錐形瓶中分別接種10 mL的水樣接種5 g泥樣，泥樣多加10 mL的無菌水。然后在25 ℃，170 r·min-1過夜進行培養(yǎng)，經(jīng)3次以上的傳代培養(yǎng)，使菌群穩(wěn)定，獲得所需的目的菌群。

對獲得的 3個菌群（濃度可達到 2×107cells·mL-1）菌液分別均勻涂布在固體CDM培養(yǎng)基上，同樣25 ℃過夜培養(yǎng)，待長出單菌落且不相接時，經(jīng)過多次的平板劃線分離，得到多個菌的純培養(yǎng)并進行標記。通過采用定性硝酸銀篩選法（qualitative AgNO3screening method）（Simeonova等，2004），通過五價砷可以和硝酸銀的顏色反應，將得到具有三價砷的氧化能力的純種菌株進行鑒定，即得到不同目的菌株。

1.4 3個菌群的三價砷耐受能力的測定

分別配制三價砷質量濃度為1、2、3、4、5 g·L-1的培養(yǎng)基100 mL，接種對數(shù)生長期細菌0.1 mL，每5 h鏡檢菌濃變化，以菌群的生長速度反映該菌群對三價砷的耐受能力，每組設3個平行實驗。

1.5 3個菌群和目的菌株的三價砷氧化能力的測定

采用砷鉬藍法（周月雯，1990），在864 nm波長下用分光光度計檢測，依據(jù)生成的終產(chǎn)物砷鉬藍的吸光度和砷質量濃度呈正相關的關系，制作標準曲線（見圖2）。

圖2 砷質量濃度的標準曲線Fig. 2 The standard curve of arsenic mass concentration

根據(jù)原始樣品砷質量濃度數(shù)據(jù)，采用0.6 g·L-1的三價砷質量濃度的100 mL培養(yǎng)基，接種對數(shù)生長期的菌液1 mL，每隔5 h檢測培養(yǎng)基中三價砷、五價砷及總砷的質量濃度的變化。根據(jù)菌種對三價砷氧化速率及最終的氧化率，檢測不同目的菌群的氧化能力。為測定目的菌株的三價砷氧化能力，配制l g·L-1亞砷酸鈉溶液，并設計對照組（CK），每隔10 h測定溶液中三價砷質量濃度的變化。每組設3個平行實驗。

1.6 目的菌株的鑒定

利用天根公司的細菌基因組DNA提取試劑盒提取目的菌株的基因組 DNA，用通用引物 27F，1492R（Deng等，2007）擴增細菌的16S rDNA基因序列。PCR擴增的程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s；55 ℃退火45 s；72 ℃延伸90 s；返回至步驟2（共32個循環(huán)）；72 ℃最后延伸10 min。將擴增產(chǎn)物進行回收和純化。利用Rsa I和Msp I對16S rDNA基因擴增片段進行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析其帶型。對典型帶型的 16S rDNA克隆子進行測序，通過 NCBI的BLASTN進行序列比對，獲得這些菌株相關的具體信息。

1.7 氧化砷基因的克隆

對具有氧化能力菌株中可能存在的 AoxB（Arsenic oxidase gene B）（Heinrich-Salmeron等，2011）進行克隆。采取巢式 PCR（Nested PCR）（Gundersen等，1996）和降落 PCR（Touchdown PCR）（Tran等，2014）結合方式對目的序列進行擴增。引物名稱序列（Fan等，2008）如下：AoxA-F：5’-ACVTTCAASTGYCCHKGYCAYTTC-3’；AoxAR1：5’-TGRTTNAGRAARTARTTNGTYTG-3’；AoxB-F：5’-TGYCAYTTYTGYATHGTNGGNTG-3’；AoxB-R2：5’-TANGCNGGNCGRTTRTGDAT-3’。首先用AoxA-F和AoxA-R1進行第一輪巢式PCR，降落PCR程序為：95 ℃預變性15 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，（9個循環(huán)，每個循環(huán)降低1 ℃）；94 ℃變性l min，46 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，（25個循環(huán)）；72 ℃最后延伸5 min；4 ℃，保存。再用AoxB-F和AoxB-R2以第1次PCR擴增的產(chǎn)物為模板，進行第2輪巢式PCR。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel和Origin Pro 9.0軟件，對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 目的菌株的篩選

將3個樣品中的細菌經(jīng)過多次的富集和平板分離，得到多種可能具有氧化三價砷能力的菌株。通過五價砷和硝酸銀的顏色反應來判別培養(yǎng)菌株是否具有三價砷的氧化能力，篩選出具有三價砷的氧化能力的菌株（如圖3所示）。

圖3 三價砷氧化菌株的硝酸銀顏色反應Fig. 3 The color reaction between strains and AgNO3

圖4 SY菌群(a)、XY菌群(b)和NY菌群(c)的三價砷耐受能力Fig. 4 As(Ⅲ) tolerance ability for SY floras (a), XY floras (b), NY floras (c)

2.2 混合菌群的三價砷耐受能力的測定

將SY、XY和NY 3個樣品經(jīng)過富集培養(yǎng)并多次傳代培養(yǎng)使菌群達到穩(wěn)定，在三價砷質量濃度為l～5 g·L-1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，鏡檢菌種的生長情況如圖4所示。SY菌群（a）在分別1、2和3 g·L-1的質量濃度下，菌群的增長速率基本相同，最高菌濃可達1.6×109cells·mL-1，在約70 h達到穩(wěn)定期。在高于3 g·L-1的三價砷質量濃度時，菌種的生長速率明顯降低，最高菌濃可達109cells·mL-1。對數(shù)生長期較長，在約120 h后才趨于達到穩(wěn)定期。XY菌群（b）總體生長趨勢和SY類似，但XY具有更高的三價砷耐受能力，能稍快地達到對數(shù)期。在低砷質量濃度時的最高菌濃可達2.0×109cells·mL-1，在高砷質量濃度的條件下，最高也可達 1.3×109cells·mL-1，在約50 h達到對數(shù)期。NY菌群（c）在低砷質量濃度時菌濃可達1.1×109cells·mL-1，隨著砷質量濃度的增高，到達穩(wěn)定期的時間逐漸增加，在最高砷質量濃度下前滯期約70 h。在約110 h的時候，菌濃也只有0.4×109cells·mL-1。因此，從最高的菌濃及高三價砷質量濃度下菌群的生長情況可知，XY具有最廣泛的砷適應濃度，SY次之，NY最差。

2.3 混合菌群的三價砷氧化能力的測定

用3個菌群分別處理含有1 g·L-1亞砷酸鈉溶液，根據(jù)各價態(tài)砷質量濃度制作曲線（圖 5）。SY菌群（a）的處理的溶液中三價砷和總砷的質量濃度持續(xù)遞減，三價砷在約 10 h氧化率便達到約75%，在約25 h三價砷被完全氧化。五價砷質量濃度在約前15 h內(nèi)以相對較快的速度持續(xù)增加，之后逐漸降低。總砷質量濃度在約35 h降至最低，去除率約為 60%。XY菌群（b）處理該質量濃度溶液時，各價態(tài)砷質量濃度的降低相對于SY來說更快速。三價砷在約20 h就已被氧化完全。總砷質量濃度在約30 h降至最低，去除率約為67%。在一定的階段內(nèi) NY菌群（c）的處理效果相對較差，曲線的趨勢也較不同于前兩者。三價砷在約35 h被氧化完全。五價砷的質量濃度基本呈一個遞增的趨勢。總砷質量濃度在約35 h降至最低，去除率約為66%。因此，在一定砷質量濃度下，XY菌群的氧化能力最強，其次為SY，最差的為NY。

圖5 SY菌群(a)、XY菌群(b)和NY菌群(c)的三價砷氧化速率Fig. 5 As(Ⅲ)-oxidating rate of SY floras (a), XY floras (b), NY floras (c)

2.4 目的菌株的鑒定

對分離得到的目的菌株，先進行16S rDNA擴增及測序，再通過NCBI的BLASTN軟件進行序列比對，所得結果見表1。菌株SMY24、SMY33、SMY22、SMY32、SMY21和SMY31均屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），SMY104屬于不動桿菌屬（Acinetobacter），SMY17、SMY25、SMY9和SMY1經(jīng)NCBI比對，在所有的已知序列中，最大的相似率只有91%，最小的相似率為76%，且都是未曾報道純培養(yǎng)的細菌。

表1 目的菌株16S rDNA序列NCBI比對結果Table 1 The objective strains’ 16S rDNA sequence alignment results from NCBI

圖6 目的菌株三價砷氧化能力Fig. 6 As(Ⅲ)-oxidating ability of the isolated objective strains

2.5 目的菌株氧化能力的檢測

在一定砷質量濃度存在條件下，檢測篩選出的目的菌株的三價砷氧化性。通過和CK比較（圖6），可以知道所獲得的目的菌株均可在一定程度上氧化三價砷，只是氧化的速度不同。

2.6 砷氧化酶基因的克隆

以目的菌株的基因組總DNA為模板，結合巢式PCR和降落PCR的方法，分別擴增目的菌株的三價砷氧化酶基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測分析所得結果（見圖7）。分析檢測結果，第1次PCR產(chǎn)物為一條大約1000 bp長度的DNA片段，第2次PCR產(chǎn)物為一條大約為700 bp左右長度的片段。大多數(shù)的篩選出的的目的菌株均可以成功擴增并克隆出三價砷氧化酶基因，但也存在個別菌株的PCR擴增結果沒有條帶，或者不存在目的條帶。類似研究結果也被很多科學家發(fā)現(xiàn)（Deng等，2007；Anderson等，2004）。這可能與菌株自身的電子傳遞相關，或者是與物種自身中間代謝產(chǎn)物或最終代謝產(chǎn)物發(fā)生作用，起到類似于三價砷氧化酶的功能。

圖7 目的菌株三價砷氧化酶基因的克隆Fig. 7 The As(Ⅲ) oxidase gene cloning of the isolated objective strains

3 結論

分別檢測3個菌群進行砷耐受能力，在5 g·L-1亞砷酸鈉溶液中培養(yǎng)，生長狀態(tài)都相對較好。處理一定質量濃度的亞砷酸鈉溶液時，三價砷快速被氧化，總砷的質量濃度也有顯著的降低，隨著時間的延長，總砷持續(xù)降低至一定質量濃度。從3個樣品中共篩選到11株三價砷氧化菌，對其進行三價砷氧化能力的檢測發(fā)現(xiàn)，它們都能在一定程度上將三價砷氧化為五價砷，只是氧化的速度不同，因此這些菌株為目的菌株。對這些菌株 16S rDNA通過NCBI的BLASTN序列比對發(fā)現(xiàn)，4株屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），1菌株屬于不動桿菌屬（Acinetobacter），3菌株在所有的已知序列中，最大的相似率只有91%，最小的相似率為76%，且都是未曾報道純培養(yǎng)的細菌。通過對目的菌株的三價砷氧化酶基因進行初步檢測，發(fā)現(xiàn)了多個菌株具有三價砷氧化酶基因（AoxB）。上述菌株的分離純化及鑒定工作，為下一步開展含砷廢水的生物處理以及砷污染土壤的生物修復等工作奠定了基礎。

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Isolation and Identification of Arsenic-oxidizing Bacteria from Shimen Realgar Mine, Hunan

YANG Yu1,2*, BAI Fei1, YANG Li1, XU Qing1, QIU Guanzhou1,2
1. School of Minerals Processing and Bioengineering, Central South University, Changsha 410083, China; 2. Key Laboratory of Biometallurgy, Ministry of Education Central South University, Changsha 410083, China

With the rapid industrialization, especially the arsenic containing gold ore mining, arsenic contamination has become a universal concerned eco-environmental problem. How to make better use of a rapid and green approach in biology to disposal of arsenic wastewater could be of great value in relieving arsenic contamination brought by industrial development, improving residents' quality of life and improving human settlements. In the present study, three samples were used as the research objects, which were collected from the water of tailings pond (SY), mine drainage from the mine tunnel 400 m below the surface (XY) and the sediment of tailings pond (NY) in the Shimen Realgar Mine, respectively. Three kinds of As(Ⅲ)-oxidizing microfloras were obtained from these three samples by enrichment culture with arsenic containing medium and subculture after several generation. The As(Ⅲ) tolerance ability was determined in the medium with l～5 g·L-1of arsenic. Results showed that the cell density of these microfloras reached 109cells·mL-1within 2～3 d under 5 g·L-1of arsenic. Results also showed that the solution containing 1 g·L-1of sodium arsenite could be completely oxidized by SY, XY and NY within 25 h, 20 h and 35 h respectively, with the decrease of total arsenic mass concentration by 66.7%. 11 As(Ⅲ)-oxidizing bacteria were obtained from those microfloras by repeated plate streaking and qualitative AgNO3screening method. The 16S rDNA of these strains were examined by sequence alignment of the BLASTN in NCBI. Results showed strains SMY24, SMY33, SMY22, SMY32, SMY21 and SMY31 are Pseudomonas, SMY104 is Acinetobacter. of all known sequences, the maximum rate of sequence similarity of SMY17, SMY25, SMY9 and SMY1 is only 91%, while the minimum is 76%, indicating they are pure culture bacteria that never been reported. By measuring the As(Ⅲ)-oxidizing ability of each strain, results showed SMY104 and SMY21 could completely remove As(Ⅲ) within 20 h. Preliminary tests for the As(Ⅲ) oxidase gene showed that most of these strains had the arsenic oxidase gene (AoxB).

Shimen realgar mine in Hunan; As(Ⅲ), As(Ⅴ); arsenic-oxidizing bacteria; arsenic oxidase gene

X172

A

1674-5906（2015）01-0133-06

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.01.020

楊宇，白飛，楊莉，許慶，邱冠周. 湖南石門雄黃礦區(qū)礦樣中的砷氧化細菌的分離及鑒定[J]. 生態(tài)環(huán)境學報, 2015, 24(1): 133-138.

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國家重點基礎研究發(fā)展計劃（“973”計劃）項目（2010CB630901）；教育部新世紀人才項目（NCET-07-0869）

楊宇（1972年生），男，副教授，博士，主要從事環(huán)境微生物學研究。Email：csuyangyu@ csu.edu.cn；*通訊作者

2014-09-28