人肝再生增強因子基因慢病毒表達載體的構建與鑒定＊

薛 峰，王伯慶，尹繼煒，易 超

新疆醫科大學附屬腫瘤醫院 肝膽胰外科（烏魯木齊 830011）

改善肝部分切除術后余肝再生能力一直是困擾肝臟外科醫生的難題。隨著分子生物學技術的不斷發展，肝細胞損傷修復過程的分子生物學機制研究逐步成為肝臟基礎研究的核心內容。肝再生增強因子（augmenter of liver regeneration，ALR）是近年來發現的一種高表達于肝細胞中的特異性分裂原，在肝細胞損傷修復過程中發揮著至關重要的作用［1－2］。本研究通過構建攜帶人ALR基因的慢病毒表達載體，并轉染BLR 3A大鼠肝細胞驗證其安全性與有效性，以期為深入研究ALR在肝再生過程中的作用機制奠定良好的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

PCR擴增試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司；ALR PCR擴增引物由生工生物工程（上海）有限公司設計合成；SacⅡ限制性內切酶、大量質粒提抽試劑盒、dNTP、Taq DNA 聚合酶、1Kb plus DNA Marker、T4連接酶購自NEB公司；pCDALR由深圳大學附屬羅湖區人民醫院李海軍教授惠贈；中間克隆載體pUC57、pLenti6/V5－D－TOPO重組慢病毒載體、ViraPowerTMPackaging Mix慢病毒包裝體系、病毒定量引物、TaKaRaMiniBEST Viral RNA/DNA Extraction kit試劑盒購自百奧邁科生物技術有限公司；BLR 3A大鼠肝細胞、Top10化學感受態細胞與293T病毒包裝細胞由中國科學院上海細胞庫提供；LipofectamineTM2000轉染試劑盒購自Invitrogen公司；兩部法反轉錄－聚合酶鏈反應試劑盒、瓊脂糖膠回收試劑盒、Trizol試劑盒購自北京天恩澤生物有限公司；DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、LB培養基、OptiMEM培養基、SDSPAGE凝膠制備試劑盒購自Gibco公司；多功能凝膠電泳槽、96孔梯度PCR儀、CO2細胞培養箱、倒置熒光顯微鏡、NU－437－400E型生物安全柜、－80℃低溫冰柜及PBS緩沖液等常用分子生物化學試劑由新疆醫科大學附屬腫瘤醫院腫瘤研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 ALR基因擴增與檢測 根據GenBank提供的人ALR基因全長信息，設計PCR擴增引物，以人胎肝cDNA為模板進行PCR擴增，擴增產物與pCD－ALR質粒（陽性對照，成功合成的ALR基因片段載體）酶切產物共同電泳對比鑒定，利用瓊脂糖膠回收試劑盒回收擴增產物送生工生物工程（上海）有限公司測序驗證。將擴增得到經驗證無誤的ALR基因片段平端連接入pUC57載體后，轉染Top10化學感受態細胞，37℃倒置培養過夜，次日擴大培養生長較好的菌落2h后行PCR菌檢，利用大量質粒提抽試劑盒提取陽性克隆質粒（pUC57－ALR）行測序鑒定。ALR基因PCR擴增引物，上游引 物：5′－GCGGAATTCGCAACGGAATGCGGA CCCACCAGAAGCGGGAC－3′；下游引物：5′－GCT GGATCCTTAGTCACAGGAGGCGTCCTTCC－3′。

1.2.2 構建pLenti6/V5－D－TOPO－ALR質粒 將含有與GenBank提供的人ALR基因信息相吻合的ALR基因片段的pUC57－ALR質粒與pLenti6/V5－D－TOPO載體用SacⅡ限制性內切酶酶切后進行連接，連接產物轉染Top10化學感受態細胞，37℃倒置培養過夜，次日同前法行PCR菌檢后SacⅡ限制性內切酶酶切鑒定，鑒定無誤的陽性克隆提抽質粒送測序后，－80℃凍存。

1.2.3 慢病毒包裝 培養293T細胞至對數生長期后，行胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，293T細胞按5×106個/mL濃度鋪10cm板，37℃、5%CO2培養箱培養至細胞生長到90%匯合度后，培養基更換為無血清培養基。用OptiMEM培養基洗滌細胞3次后，將293T細胞加入5mL OptiMEM培養基，37℃、5%CO2培養箱孵育20min。參照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書，將5μg LipofectamineTM2000 與 10 μg ViraPowerTMPackaging Mix、5 μg pLenti6/V5－D－TOPO－ALR質 粒 混 合 后，37 ℃、5%CO2培養箱孵育20min。加入孵育后的293T細胞中培養8h，去除培養基，并用PBS緩沖液沖洗細胞3次。加入DMEM培養基25mL，37℃、5%CO2培養箱培養72h。完成轉染后，熒光顯微鏡下觀察293T細胞熒光蛋白表達情況，評價轉染效果，確定轉染成功后，收集培養瓶內上清液，4℃、離心15min（離心半徑20cm，轉速4 000r/min），上清液0.45μm微孔濾膜過濾。相同條件下再次離心15min，上清液即為病毒濃縮液，分裝后－80℃凍存。

1.2.4 病毒滴度測定 TaKaRaMiniBEST Viral RNA/DNA Extraction kit試劑盒提取250μL病毒液RNA后，稀釋至30μL，取2μL RNA以101～1 011copies/μL的pLenti6質粒作為標準樣品，進行實時定量PCR檢測測定病毒滴度。

1.2.5 攜帶人ALR基因慢病毒表達載體轉染BLR 3A大鼠肝細胞 BLR 3A大鼠肝細胞培養至對數生長期后，行胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，同前293T細胞鋪10cm板培養24h至90%匯合度。37℃預熱的0.01mol/L PBS緩沖液沖洗細胞3次后，加入2mL DMEM培養基，37℃、5%CO2培養箱孵育20min。參照LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書，加入500μL病毒液與10μg LipofectamineTM2000，37 ℃、5%CO2培養箱孵育72h后，觀察BLR 3A大鼠肝細胞生長情況及熒光蛋白表達情況。

1.2.6 RT－PCR法檢測BLR3A大鼠肝細胞人ALR基因表達 上述轉染72h的BLR 3A大鼠肝細胞，取1×107個細胞胰蛋白酶消化后，采用Trizol試劑盒提取細胞總RNA。參照兩步法RTPCR試劑盒說明書，檢測人ALR基因表達，反應參數設定為：95 ℃、5min；94 ℃、30s；52 ℃、40s；72℃、30s；72℃、7min；28個循環，內參照β－actin。以加入空慢病毒載體與等量PBS緩沖液的BLR 3A大鼠肝細胞為對照。ALR基因PCR擴增引物，上游引物：5′－GCGGAATTCGCAACGGAATGCGG ACCCACCAGAAGCGGGAC－3′；下游引物：5′－GC TGGATCCTTAGTCACAGGAGGCGTCCTTCC－3′。

2 結果

2.1 ALR基因擴增電泳檢測

擴增的目的基因與pCD－ALR質粒中ALR基因片段位置一致，均位于 Marker的300～400bp，與GenBank報道ALR基因長度（378bp）一致（圖1）。

圖1 ALR基因與pCD－ALR質粒酶切產物凝膠電泳圖

2.2 pLenti6/V5－D－TOPO－ALR質粒酶切電泳檢測

經酶切后獲得大小約7 000bp（慢病毒表達載體質粒）和378bp兩個條帶，證實ALR基因片段成功插入pLenti6/V5－D－TOPO載體中（圖2）。

2.3 基因測序

擴增產物、pUC57－ALR質粒與pLenti6/V5－DTOPO－ALR質粒酶切后測序結果經DNAStarSeqMan軟件分析顯示，合成的ALR基因與GenBank報道一致，無堿基錯排、缺失與突變。

圖2 pLenti6/V5－D－TOPO－ALR質粒酶切電泳圖

2.4 病毒滴度及慢病毒包裝293T細胞熒光蛋白表達

實時定量PCR測得病毒滴度為1.48×107v.p./mL。慢病毒質粒轉染293T細胞72h后熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白表達情況，轉染率為92.31%，培養72h過程中僅有少量細胞出現病變脫落（圖3）。

圖3 轉染293T細胞72h后熒光顯微鏡下觀察（×100）

2.5 構建的攜帶人ALR基因慢病毒表達載體轉染BLR 3A大鼠肝細胞

轉染后72h培養過程中，僅少量BLR 3A細胞發生病變脫落，熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白表達結果顯示，轉染率達88.49%。RT－PCR電泳結果顯示，僅人ALR慢病毒表達載體轉染的BLR 3A大鼠肝細胞表達人ALR基因，加入空慢病毒載體與等量PBS緩沖液的BLR 3A大鼠肝細胞均未見有陽性表達條（圖4～5）。

圖4 BLR 3A大鼠肝細胞轉染72h后熒光顯微鏡下觀察（×100）

圖5 BLR 3A細胞RT－PCR凝膠電泳照片

3 討論

由于肝臟外科技術的飛速發展，肝部分切除或肝移植術后，肝臟再生能力及其調控機制逐步成為肝臟基礎研究領域的核心問題。目前已知與肝臟再生相關的因子超過百種，但多數不具有肝臟特異性［3］。ALR是近年發現的一種在肝細胞內高度表達且高效促肝細胞增殖的分裂原，其在肝臟損失修復過程中發揮著至關重要的作用［1－2］。

ALR由Hagiya等［4］于1994年在大鼠肝組織中發現，隨后學者們依據大鼠ALR基因擴增引物，利用PCR技術從人胎肝中篩選成功獲得人ALR cDNA克隆。ALR在促進肝細胞增殖方面的高效性已成為共識。最近，Tang等［5］研究顯示，在膽道梗阻誘導的急性黃疸性肝炎模型中，ALR可顯著促進肝細胞的增殖，以加速受損肝臟的修復。Wang等［6］研究顯示，ALR在大鼠肝移植模型肝臟損傷修復中發揮著關鍵性作用，外源性重組ALR可明顯加速移植肝臟組織的生長，并有效提高大鼠生存率。上述研究證實了ALR在肝臟損傷修復過程中的關鍵性作用，但其機制尚不明確。為深入研究ALR基因在肝臟部分切除后余肝再生中作用機制，本研究采用基因重組技術構建了攜帶ALR基因的慢病毒表達載體，并通過電泳、酶切鑒定及基因測序分析的方法證實了其準確性，為進一步研究奠定了實驗基礎。

無論是基因功能的研究還是基因治療的實現，最關鍵的環節是如何選擇合適載體。理想的載體既要保證實現有效的基因轉移，又可使目的基因得到穩定表達，同時還可兼顧安全性。慢病毒表達載體是一種來源于人類免疫缺陷病毒－1的新型病毒載體，具有高效轉染能力，目前已廣泛用于分子生物化學研究的各個領域［7－10］。安全性方面，選擇與病毒載體成分不同源的包裝體系即可防止其恢復為野生免疫缺陷病毒－1，從而避免致病的可能［11］。與以往常用的反轉錄病毒載體和腺病毒載體相比，慢病毒載體具有可感染處于分裂期和非分裂期細胞，可連接基因片段長，可實現基因穩定表達且免疫反應小等優點［12－15］。

本研究采用酶切連接的方法成功構建了攜帶目的基因的慢病毒表達載體，保證了目的基因插入方向的準確性，防止反義基因的表達。轉染BLR 3A大鼠肝細胞的過程中，僅有少部分大鼠肝細胞發生脫落壞死，轉染率達88.49%，且RT－PCR結果顯示，被轉染的大鼠肝細胞可穩定表達ALR基因。研究結果證實，慢病毒表達載體是用于基因研究乃至基因治療的理想載體，兼具安全性與有效性。但值得注意的是，本研究中獲得的慢病毒滴度僅為1.48×107v.p./mL，尚不足以應用于臨床研究，其臨床應用的安全性也需深入研究證實。

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