蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶6調(diào)控前列腺癌發(fā)生的分子機(jī)制＊

徐 瑩，閻 英，柳云恩

1.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 放射治療科（沈陽 110840）；2.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 急診醫(yī)學(xué)部，全軍重癥戰(zhàn)創(chuàng)傷救治中心實驗室（沈陽 110840）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是世界常見惡性腫瘤之一，多見于歐美等國家［1－2］。雄激素受體（androgen receptor，AR）作為核受體超家族蛋白成員，是一種配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子，其結(jié)構(gòu)主要包括轉(zhuǎn)錄激活功能域 1（activation function 1，AF－1）及AF－2。AF－1不依賴于配體的結(jié)合，AF－2需要同源配體結(jié)合，通過招募大多數(shù)的 AR輔助因子［3－4］，參與蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)間的相互作用。當(dāng)AR與配體（如雄激素）結(jié)合后，AR與其分子伴侶解離，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核，同時招募特定的轉(zhuǎn)錄輔助調(diào)節(jié)因子形成復(fù)合物［5］，結(jié)合到靶基因的反應(yīng)元件上，通過改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄［6－7］。 研究［8－9］發(fā)現(xiàn)，AR在PCa的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，它通過調(diào)控AR下游PCa相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)PCa的發(fā)生發(fā)展。迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)大量的AR輔助調(diào)控因子，如 p68［10］、LSD1［11］、RNF6［12］、ARD1［13］、JARID1B［14］和 FLH2［15］等，在 PCa中過表達(dá)，并促進(jìn)癌癥細(xì)胞的增殖。因此，研究AR活性調(diào)控的分子機(jī)制對于PCa的治療具有重要意義。

蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（protein arginine methyltransferases，PRMTs）家族具有催化精氨酸甲基化的作用，其功能取決于底物特異性及其亞細(xì)胞定位［16］。PRMTs根據(jù)其催化甲基化的類型可以分為3類，蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶6（protein arginine methyltransferase 6，PRMT6）屬于Ⅰ類，催化酶胍基氮的精氨酸殘基甲基化［17－18］。研究［19］發(fā)現(xiàn)，PRMT6可以抑制腫瘤抑制基因p53的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（the cyclindependent kinase，CDK）的抑制基因 p21 是PRMT6重要的直接下游靶基因，通過抑制p21從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞衰老。PRMT6基因敲除可以使細(xì)胞周期停滯，提示PRMT6在細(xì)胞周期調(diào)控中也起重要作用［20］。p21是多種腫瘤抑制基因和癌基因的下游基因，它參與了乳腺癌［21－22］、骨肉瘤［18］和肝癌［23］等腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

目前，PRMT6是AR的一種輔助激活因子，它不僅可以激活正常表達(dá)的AR，也可以顯著激活突變的AR。PRMT6的類固醇受體基序可以與AR的AF－2相互作用，從而起到激活作用［24］。然而，PRMT6調(diào)控PCa發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚不清楚。因此，本研究旨在探討PRMT6在PCa細(xì)胞中的作用及調(diào)控機(jī)制，為PCa的診斷及治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 前列腺增生（BPH）和PCa的免疫組織化學(xué)分析

福爾馬林固定石蠟包埋的BPH和PCa的病理切片來源于沈陽軍區(qū)總醫(yī)院。數(shù)據(jù)采集及組織應(yīng)用研究通過人體倫理研究委員會批準(zhǔn)。實驗共有100例組織，其中BPH標(biāo)本50例，PCa組織標(biāo)本50例。對所有組織行免疫組織化學(xué)染色，檢測標(biāo)本PRMT6的表達(dá)水平。抗鼠的多克隆抗體PRMT6（santa，sc－271744，1∶100）、親和素生物素標(biāo)記的第2抗體及堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉素工作液孵育，DAB顯色后，核用蘇木精復(fù)染。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

CWR22Rv1、LNCaP、DU145和 VCaP細(xì)胞（購自沈陽匯佰生物科技有限公司）維持在RPMI1640（GIBCO－BRL）培養(yǎng)基中。PC3細(xì)胞維持在F12培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞培養(yǎng)基含有10%胎牛血清（FBS）、2mmol/L谷氨酰胺、100U/mL鏈霉素和青霉素。細(xì)胞于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 質(zhì)粒、siRNA轉(zhuǎn)染

PRMT6（ID：55170）表達(dá)質(zhì)粒及siRNA由沈陽匯佰生物科技有限公司制作，體外轉(zhuǎn)染CWR22Rv1和LNCaP細(xì)胞利用LipofectamineTM 2000（Invitrogen）試劑盒，具體步驟請參照試劑說明書。

1.4 Real Time PCR

總RNA 提取應(yīng)用Trizol試劑（Invitrogen）。反轉(zhuǎn)錄使用Super－ScriptⅡ（Invitrogen），cDNAs通過Real Time PCR量化使用SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）和 aMx3000Pinstrument（Agilent StrataGene）儀器。PSA和KLKZ基因表達(dá)分析采用Stratagene Mx3000P軟件。

1.5 Western blot檢測

實驗蛋白樣品加入相應(yīng)比例的SDS凝膠上樣緩沖液（6×Loading Buffer），煮沸變性5min，SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，然后將膜移至5% 的脫脂奶粉PBST緩沖液室溫封閉1h，PBST洗膜3次。加入一抗 PRMT6（santa，sc－271744，1∶2 000）和 GAPDH（santa，sc－365062，1∶4 000），4 ℃ 孵育過夜。用PBST洗膜3次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠二抗，室溫孵育1h。洗膜3次，ECL顯影。

1.6 繪制細(xì)胞生長曲線和細(xì)胞增殖

分別接種22Rv1和LNCaP于12孔板中，每孔約5萬個細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染siPRMT6及對照siRNA，DHT處理及不處理。于0、24、48、72、96、120h時進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線。分別接種22Rv1和LNCaP于6孔板中，每孔約5萬個細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染siPRMT6及對照siRNA，DHT處理及不處理后5d，多聚甲醛固定，錐蟲藍(lán)染色，照相。

1.7 Transwell小室培養(yǎng)

22Rv1和LNCaP細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染siPRMT6及對照siRNA后，撤血清饑餓12～24h。接種5萬個細(xì)胞于Transwell小室。加入500μL含F(xiàn)BS或趨化因子的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48h后，95%乙醇固定10 min，錐蟲藍(lán)染色，棉簽擦去小室上室內(nèi)多余的細(xì)胞，照相。

1.8 流式細(xì)胞技術(shù)

22Rv1和LNCaP分別轉(zhuǎn)染siPRMT6及對照siRNA，DHT處理及不處理24h后，胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，75%乙醇固定，IP染液染色，37℃孵育1h，上機(jī)檢測。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，根據(jù)資料的分布特征，分別選擇χ2檢驗、mann－whitney U和方差分析方法進(jìn)行比較，所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)概率檢驗。檢驗水準(zhǔn)α設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 PRMT6在PCa中高表達(dá)

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRMT6在PCa中高表達(dá)，而在BPH中表達(dá)較低，對PRMT6的表達(dá)情況評分并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。此外，采用Western blot檢測PRMT6在5種PCa細(xì)胞系中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRMT6均有表達(dá)（圖1）。

圖1 PRMT6在PCa中高表達(dá)

2.2 PRMT6促進(jìn)AR下游靶基因PSA和KLK2的轉(zhuǎn)錄

本研究定制了1種PRMT6的表達(dá)質(zhì)粒及3種PRMT6的siRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRMT6過表達(dá)促進(jìn)PSA和KLK2的轉(zhuǎn)錄，而敲除PRMT6后PSA和KLK2的轉(zhuǎn)錄水平降低（圖2）。

圖2 PRMT6促進(jìn)AR下游靶基因PSA和KLK2的轉(zhuǎn)錄

2.3 PRMT6促進(jìn)PCa細(xì)胞的增殖

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，PRMT6基因敲除可顯著減少PCa22Rv1和LNCaP細(xì)胞增殖。同時，通過將PRMT6基因敲除后分別轉(zhuǎn)染到22Rv1和LNCaP細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)PRMT6基因敲除明顯抑制細(xì)胞的增殖（圖3）。

2.4 PRMT6促進(jìn)PCa細(xì)胞周期的進(jìn)程

利用流式細(xì)胞技術(shù)研究PRMT6對PCa細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示，敲除PRMT6后22Rv1和LNCaP細(xì)胞停滯在G1期的細(xì)胞明顯增多（圖4）。

2.5 PRMT6促進(jìn)PCa細(xì)胞的遷移

通過Transwell小室實驗研究PRMT6對PCa細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除PRMT6后，22Rv1和LNCaP細(xì)胞的遷移率降低（圖5）。

圖3 PRMT6促進(jìn)PCa細(xì)胞的增殖

圖4 PRMT6促進(jìn)PCa細(xì)胞周期的進(jìn)程

圖5 PRMT6促進(jìn)PCa細(xì)胞的遷移

3 討論

PCa是歐美國家常見的惡性腫瘤之一，是男性致死的第2大癌癥。中國PCa的發(fā)病率較低，但近年來有逐漸上升的趨勢［25－26］。目前，PCa的治療方法主要以內(nèi)分泌治療為主，但大多僅在早期有效，最終發(fā)展成趨勢抵抗的PCa，難以治愈［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，PRMT6在PCa中高表達(dá)，它通過促進(jìn)AR下游靶基因PSA和KLK2的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控PCa的進(jìn)程。此外，PRMT6還促進(jìn)PCa細(xì)胞增殖，加快細(xì)胞周期的進(jìn)程和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移。

本研究通過免疫組織化學(xué)檢測BPH和PCa患者的病理石蠟切片，發(fā)現(xiàn)PCa組織中PRMT6的表達(dá)水平明顯高于BPH，同時通過Western blot技術(shù)檢測5種PCa細(xì)胞系中PRMT6的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PRMT6在5種細(xì)胞系中均有表達(dá)，結(jié)果提示PRMT6在PCa中呈高表達(dá)。研究［24］證 實，PRMT6在多種癌癥中具有生理功能，它是AR的一種輔助激活因子，可以與ARAF－2相互作用，激活A(yù)R。研究［28］發(fā)現(xiàn)，PCa組織中PRMT6表達(dá)水平顯著高于正常的前列腺組織，它能較好地區(qū)分正常組織和腫瘤組織，本研究結(jié)果與其相似。結(jié)果提示，PRMT6作為AR的一種輔助激活因子，可能在PCa的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。然而，PRMT6調(diào)控PCa發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，目前尚不清楚。

PCa發(fā)生發(fā)展與AR密切相關(guān)，AR是核受體超家族蛋白的成員之一，它在前列腺生長發(fā)育及生理功能方面起重要作用。AR表達(dá)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控受其轉(zhuǎn)錄輔助調(diào)控因子的調(diào)節(jié)，一旦AR的轉(zhuǎn)錄輔助調(diào)控因子發(fā)生改變，會引起AR及其下游靶基因的表達(dá)異常，導(dǎo)致PCa和雄激素不敏感癥等AR相關(guān)疾病。PRMT6是正常和突變AR的特異性輔助激活因子，其與AR相互作用在AR突變時顯著增強(qiáng)，通過PRMT6類固醇受體相互作用區(qū)域LXXLL和AR激活功能2。AR的轉(zhuǎn)錄激活需要PRMT6的催化活性和Akt結(jié)構(gòu)域精氨酸殘基的甲基化參與［24］。本研究選取AR陽性激素非依賴的22Rv1細(xì)胞和AR陽性激素依賴的LNCaP細(xì)胞進(jìn)行研究。通過將過表達(dá)及敲除PRMT6的siRNA轉(zhuǎn)染至22Rv1和LNCaP細(xì)胞中，采用Real Time PCR研究PRMT6表達(dá)改變對AR下游促癌基因PSA和KLK2的轉(zhuǎn)錄影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRMT6可以促進(jìn)PSA和KLK2的轉(zhuǎn)錄，提示PRMT6可能通過調(diào)控AR下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)PCa的發(fā)生發(fā)展。

本研究通過繪制細(xì)胞生長曲線、克隆實驗、流式細(xì)胞技術(shù)和Transwell實驗，研究PRMT6對22Rv1和LNCaP細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及遷移的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PRMT6可以促進(jìn)22Rv1和LNCaP的細(xì)胞增殖，調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程，敲除PRMT6后細(xì)胞周期進(jìn)程中主要作用于G1期，同時PRMT6可以促進(jìn)22Rv1和LNCaP的遷移。研究［29］發(fā)現(xiàn)，p21是一種強(qiáng)效的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，在促進(jìn)G1細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞衰老方面發(fā)揮重要作用。p21是多種腫瘤抑制基因和癌基因的下游靶基因，它在大多數(shù)的腫瘤包括乳腺癌中表達(dá)下調(diào)。PRMT6作為一種已知的轉(zhuǎn)錄輔助因子直接抑制p21啟動子。PRMT6基因敲除導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞中p21抑制，同時導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞衰老。結(jié)果提示，PRMT6作為乳腺癌細(xì)胞中癌基因，因具有促進(jìn)細(xì)胞生長和抑制衰老的特點，可以作為腫瘤治療的潛在靶點。PELP1與PRMT6相互作用，并改變PRMT6的功能，抑制PRMT6，可以減輕PELP1介導(dǎo)的雌激素受體激活、細(xì)胞增殖和集落形成。PELP1與PRMT6被募集作為雌激素受體的靶基因，協(xié)同調(diào)節(jié)參與腫瘤形成的基因選擇性剪接，結(jié)果提示，PELP1－PRMT6軸可能是乳腺癌治療的潛在靶點。此外，研究［30］發(fā)現(xiàn)，PRMT6過表達(dá)抵消由野生型p16誘導(dǎo)的人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞周期阻滯在G1期，同時過表達(dá)的PRMT6能夠與p16相互作用，導(dǎo)致p16－CDK4關(guān)聯(lián)強(qiáng)度降低。此前文獻(xiàn)［31］報道，在PRMT6過表達(dá)的乳腺癌 MCF7細(xì)胞系中，細(xì)胞生長率和集落形成能力明顯滯后于正常對照組細(xì)胞，血小板反應(yīng)蛋白－1（TSP－1）是一種有效天然的血管生成抑制劑，它在PRMT6過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞中明顯上調(diào)，由PRMT6過表達(dá)導(dǎo)致的轉(zhuǎn)移和侵襲的抑制可以通過特異性敲除TSP－1基因緩解，結(jié)果提示，PRMT6過表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動和侵襲調(diào)節(jié)相關(guān)。

總之，PRMT6在PCa中高度表達(dá)并通過調(diào)節(jié)AR下游靶基因的表達(dá)促進(jìn)PCa的發(fā)生發(fā)展，同時PRMT6可調(diào)控PCa細(xì)胞的細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞的增殖及遷移。

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