以PHBⅤ為固相碳源同時去除地下水中硝酸鹽氮和對氯苯酚的試驗研究

趙蘭，王婷，吳為中

北京大學環境科學與工程學院，北京 100871

以PHBⅤ為固相碳源同時去除地下水中硝酸鹽氮和對氯苯酚的試驗研究

趙蘭，王婷，吳為中*

北京大學環境科學與工程學院，北京 100871

化肥和農藥的施用導致中國的地下水中硝酸鹽氮和農藥污染同時存在，并成為威脅人體健康的重要因素之一。其中氯酚類物質是一類常見的農藥，具有高毒性和難降解性。目前，關于固相反硝化用于硝酸鹽氮和對氯苯酚同時去除的研究較少，并且對微生物群落結構演變情況的分析還鮮見報道。論文以聚羥基丁酸戊酸共聚酯（PHBV）為反硝化固體碳源，通過序批試驗研究同步去除硝酸鹽氮和對氯苯酚的效果，并探討對氯苯酚的加入對反硝化速率的影響；利用末端限制性長度多態性分析（T-RFLP）技術，使用Alu Ⅰ酶切總細菌16S rRNA，研究對氯苯酚的存在對微生物群落的影響。結果表明，（1）在50 mg·L-1的硝酸鹽氮（NO3--N）的濃度水平下，對氯苯酚（4-CP）的加入前后，硝酸鹽氮（NO3--N）的去除率為（97.5±1.2）%和（95.3±1.7）%，總體上使去除效果略有降低；在10 mg·L-1的質量濃度水平下，對氯苯酚24 h的平均去除率為45.4%，其去除85.5%是由于微生物的降解作用引起的。（2）從對氯苯酚的加入到第45天的時間內，反硝化速率表現為先下降后上升，說明對反硝化速率起到先抑制后促進的作用。（3）在對氯苯酚加入前后45 d內，系統微生物群落結構發生明顯的變化，趨向于多樣化和均勻化。

對氯苯酚；硝酸鹽氮；固相反硝化；T-RFLP

中國是一個農業大國，由于化肥和農藥的施用常同時存在，因而在農藥污染嚴重的地區硝酸鹽污染問題也十分嚴重（Hallberg，1987）。在世界范圍內，較多地區的地下水中都存在 NO3--N和農藥濃度較高的環境污染問題，而 NO3--N和農藥濃度過高，都會對人體健康產生不同形式和不同程度的負面影響，因而尋找經濟高效的去除手段是十分必要的（Aslan和Turkman，2006）。

氯酚類物質是一類常見的農藥，并且在工業中廣泛用做染料和防腐劑等。因為苯環和氯取代基的存在使得其結構十分穩定，進入環境后可長期存在，屬于難降解有機物并具有生物毒性（Haggblom，1990）。單氯酚可在飲用水加氯消毒的過程中產生，是農藥和氯代芳烴的分解產物（Pritchard，1987）。在一些地區，地下水中的氯酚類物質濃度可以達到相當高的水平，例如在芬蘭南部受污染的地下水中檢測到氯酚質量濃度達 25～55 mg·L-1（Saia等，2007）。因而地下水中氯酚類物質的去除是保證飲用水水質的關鍵之一。

固相反硝化是一種新型的反硝化脫氮工藝，以可生物降解聚合物作為反硝化微生物有機碳源，同時充當微生物膜的載體，由于其僅能在微生物酶的作用下緩慢釋放有機物質，解決了傳統工藝外投加液體碳源（Hallinetal，1996；Menasvetaetal，2001）時存在的用量難以控制，易造成出水的二次污染等問題。研究較為廣泛的可生物降解聚合物有：PCL（Boley和Muller，2005；Wang和Wang，2009；Wu等，2013a），PBS（Wu等，2013b），PLA（Fan等，2012），PHBV（Khan等，2007；Mergaert等，2001）等。

目前國內外關于反硝化過程中同步去除農藥的研究有一些報道。Aslan和Turkman等（2004）研究了以麥秸為基質同步去除的飲用水中的硝酸鹽氮和硫丹（a+β）；Boley等（2006）利用PCL作為反硝化碳源和生物膜載體研究了飲用水中硝酸鹽氮和農藥（硫丹）的同時去除；Wang等（2013）使用玉米芯作為基質，研究了硝酸鹽氮和五氯苯酚的同時去除。但關于農藥類有毒物對脫氮效率的影響以及對微生物群落的演變情況還鮮見報道。

論文研究以聚羥基丁酸戊酸共聚酯（PHBV）為固體碳源，通過固相碳源反硝化序批試驗，研究NO3--N的反硝化脫氮、對氯苯酚的同步去除效果，探討對氯苯酚的存在對反硝化效果的影響以及對微生物群落的影響，為固相反硝化用于同步脫氮和去除農藥的技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用PHBV為圓柱形固體顆粒，平均高度為3 mm，平均直徑為3 mm，每粒質量約為0.02 g，比表面積為21.195 cm2·g-1。實驗用水為人工配水，在自來水中加入NaNO3和KH2PO4，使NO3--N和PO43--P質量濃度分別維持在50和10 mg·L-1左右。接種活性污泥取自肖家河污水處理廠二沉池。

1.2 試驗方法

（1）接種馴化試驗

在250 mL錐形瓶中加入40 g PHBV碳源，加入75 mL活性污泥與75 mL營養液（NO3--N質量濃度為100 mg·L-1，PO43--P質量濃度為10 mg·L-1），采用封口膜封口，在全溫振蕩培養箱內進行培養，維持25 ℃恒溫，轉速為100 r·min-1，培養2 d后監測水中的 NO3--N濃度，當 NO3--N質量濃度低于 2 mg·L-1時，更換150 mL配水（NO3--N質量濃度為50 mg·L-1，PO43--P質量濃度為10 mg·L-1），直至每日水中NO3--N質量濃度穩定低于2 mg·L-1時接種掛膜完成。

（2）對照序批試驗

全部反應裝置均保持每日更換 150 ml配水（NO3--N質量濃度為50 mg·L-1，PO43--P質量濃度為10 mg·L-1）。實驗組在每日更換的配水中加入對氯苯酚，并逐日提高濃度，1周后達到目標質量濃度10 mg·L-1。實驗組和對照組每日對出水NO3--N濃度進行監測，實驗組同時測定水中對氯苯酚濃度。

（3）對氯苯酚對反硝化速率影響試驗

進行3組平行實驗，3組實驗分別在加入對氯苯酚之前、達到目標濃度之后第5、25和45天進行反硝化動力學實驗和DNA提取。

（4）對氯苯酚降解試驗

隨機選取兩個實驗組，其中一組加入氯霉素抑制微生物活性（Armenante等，1996），兩組同時加入試驗配水（NO3--N質量濃度為50 mg·L-1，PO43--P質量濃度為10 mg·L-1，對氯苯酚10 mg·L-1），并逐時取樣測定水中對氯苯酚濃度來研究對氯苯酚的降解和吸附特性。

（5）生物群落結構研究

按照DNA提取試劑盒（上海，博彩）產品說明書提取細菌總DNA，對16S rRNA基因進行PCR擴 增 ， 擴 增 引 物 序 列 27F： 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’； 1492R： 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR擴增正向引物5’端用6-羧基二乙酸熒光素（FAM）標記，引物由上海生工有限公司合成。擴增條件：94 ℃，4 min；94 ℃，1 min，56 ℃，92 s，72 ℃，2 min，30個循環；72 ℃，10 min。得到的擴增產物用限制性內切酶Alu Ⅰ（日本，Takara）在37 ℃條件下酶切1 h，樣品委托北京諾賽基因組研究中心有限公司進行基因掃描分析。

對T-RFLP的圖譜，采用Peak scanner軟件和T-Rex在線分析軟件進行分析，去除片段長度在35 bp以下和500 bp以上的片段。

1.3 測定方法

水樣經0.45 μm濾膜過濾后，用紫外分光光度法測定 NO3--N濃度。對氯苯酚濃度的測定采用HPLC法，以峰面積定量，C18反相色譜柱，柱溫25 ℃，流動相為V(甲醇)∶V(水)=0.8∶0.2，流速為1 mL·min-1。

圖1 實驗組(加4-CP)和對照組(無4-CP)的反硝化效果Fig. 1 Denitrification performance of the experimental group and control group

2 結果與討論

2.1 對氯苯酚對反硝化效果的影響

對于 50 mg·L-1的 NO3--N，實驗組和對照組NO3--N平均質量濃度分別為(1.23±0.6)、(2.39±0.9) mg·L-1， 平 均 去 除率 分 別 為 (97.5±1.2)%和(95.3±1.7)%，均實現了較好的脫氮效果。但是對比加入對氯苯酚的實驗組和對照組的長期反硝化效果可以看出（圖1）：在實驗期間內，實驗組的硝酸鹽去除率普遍低于對照組，平均降低2.2%。這說明在對氯苯酚存在的情況下，反硝化菌的活性受到一定程度的抑制，反硝化作用受到影響，硝酸鹽氮的去除率略有降低。

在實驗組中（圖2），對氯苯酚原始質量濃度約為10 mg·L-1，經24 h反應后，平均質量濃度降至5.5 mg·L-1，平均去除率為45.4%，去除效果比較穩定。這表明在試驗系統中，存在具有降解對氯苯酚能力的微生物，能夠在固相碳源存在的條件下進行對氯苯酚的去除過程。

圖2 實驗組對氯苯酚去除效果Fig. 2 The removal performance of the experimental group (with 4-CP)

2.2 對氯苯酚的加入對反硝化速率的影響

在加入對氯苯酚之前以及達到目標質量濃度10 mg·L-1后的第5、25和45天分別進行反硝化動力學實驗，3組平行實驗，結果如圖3所示。

圖3 4個時間點的反硝化速率Fig. 3 Denitrification rate of four time points

在加入對氯苯酚前，在6 h NO3--N降至5 mg·L-1以下，在剛加入10 mg·L-1的對氯苯酚后的第5天，反硝化速率明顯受到抑制，NO3--N降至5 mg·L-1以下需7 h。而在第25天和第45天的實驗結果中發現反硝化速率逐漸加快。第 25天的反硝化速率與未加入前的反硝化速率較為接近，而在加入后第45天僅在4.5 h內NO3--N就降至5 mg·L-1以下。這說明對氯苯酚的加入對于反硝化速率起到先抑制后促進的作用。對氯苯酚具有生物毒性，在剛加入時會對部分反硝化微生物產生毒害作用，因而表現為反硝化速率降低；而經過一段適應期后，反硝化菌逐漸適應對氯苯酚的存在，同時對氯苯酚的加入可能會對微生物產生誘導作用，因而使微生物多樣性增加，從而促進不同微生物之間的協同作用，表現為反硝化速率的加快。

2.3 反硝化條件下4-CP的降解和吸附

為了研究反硝化條件下生物膜對于對氯苯酚的吸附作用（圖4），加入氯霉素來抑制微生物的降解活性。對于初始質量濃度為 10 mg·L-1的對氯苯酚，生物膜在2 h內達到了吸附飽和狀態，水中對氯苯酚質量濃度維持在9.0 mg·L-1左右保持不變。在研究降解的過程中發現，微生物對于對氯苯酚的降解呈現一級動力學的規律，在10 h內可以實現對氯苯酚從10 mg·L-1到3.1 mg·L-1的降解，其中吸附作用引起的去除率為 14.5%，對氯苯酚的去除主要依靠微生物降解作用，而生物膜的吸附去除作用并不明顯。在王旭明等（2009）以可生物降解餐盒為碳源對于對氯苯酚和硝酸鹽同時去除的研究中，對于30 mg·L-1的對氯苯酚，吸附作用引起的去除率為23%。

圖4 反硝化條件下對氯苯酚的降解和吸附Fig. 4 Degradation and adsorption under the denitrification condition

2.4 微生物群落多樣性變化分析

總細菌 16S rRNA基因 Alu Ⅰ酶切得到的T-RFLP結果中，刪去相對峰面積（峰面積/總面積）低于 2%的片段，進行歸一化處理。不同時期（分別為加入對氯苯酚前、加入后5、25、45 d對應1、2、3和4）生物樣品中的主要片段及其相對峰面積變化如圖5所示。

圖5 16S rRNA基因T-RFLP結果(AluⅠ)Fig. 5 The T-RFLP result of 16S rRNA gene

加入對氯苯酚前T-RFs數目為9，加入后5 d增加至13種，新出現了T-RFs 323、434、158等，T-RFs 236、108則消失了。T-RFs 79相對豐度逐漸降低，在加入第45天消失，而T-RFs 37、66、147則隨時間逐漸增多，在第 45天的樣品中成為優勢片段。T-RFs 87在加入對氯苯酚前相對豐度近40%，具有絕對的優勢性，在加入對氯苯酚后相對豐度顯著下降；而T-RFs 147則相反。對氯苯酚的加入使一部分T-RFs消失，新出現更多T-RFs，T-RFs優勢性發生明顯改變，趨向多樣化和均勻化。這說明對氯苯酚淘汰了一部分不具有耐受性的微生物，誘導產生了多種新型微生物，微生物多樣性明顯增加，原有優勢片段對應微生物的優勢性降低，不同微生物所占比例更加均勻。

此外，在對氯苯酚的加入對反硝化效果影響的試驗中，對氯苯酚的加入使得硝酸鹽氮的去除率降低，這與加入對氯苯酚之后優勢片段T-RFs 87相對豐度大大降低是有一定關聯性的。

3 結論

（1）對照組和實驗組的硝酸鹽氮平均去除率分別為(97.5±1.2)%和(95.3±1.7)%，對氯苯酚的加入會降低硝酸鹽的去除率，實驗組相對于對照組平均降低2.2%。對氯苯酚的平均去除率為45.4%。

（2）反硝化速率受對氯苯酚影響，在加入對氯苯酚第5天，反硝化速率降低；第25天恢復到加入前，第 45天反硝化速率提高。體現為先抑制后促進的過程。本實驗對氯苯酚的去除主要依靠微生物的降解作用。

（3）對氯苯酚的加入使系統生物群落結構發生很大改變，原有的優勢片段相對豐度大大降低，新出現許多新片段，整體趨向于多樣化和均勻化。

ARMENANTE P, COLELLA L, KAFKEWITZ D, et al. 1996. Effect of a biofilm on the adsorption of 4-chlorophenol on activated carbon[J]. Applied and Environmental Microbiology, 460(5/6): 667-672.

ASLAN S, TURKMAN A. 2004. Simultaneous biological removal of endosulfan( alpha plus beta) and nitrates from drinking waters using wheat straw as substrate[J]. Environment International, 30: 449-455.

ASLAN S, TURKMAN A. 2006. Nitrate and pesticides removal from contaminated water using biodenitrification reactor[J]. Process Biochemistry, 41: 882-886.

BOLEY A, MULLER W. 2005. Denitrification with polycaprolactone as solid substrate in a laboratory-scale recirculated aquaculture system[J]. Water Science and Technology, 52: 495-502.

BOLEY A, UNGER B, MULLER W R, et al. 2006. Biological drinking water treatment for nitrate and pesticide (endosulfan) elimination[J]. Water Science Technology( Water Supply), 6: 123-127.

FAN Z X, HU J, WANG J L. 2012. Biological nitrate removal using wheat straw and PLA as substrate[J]. Environmental Technology, 33: 2369-2374.

HALLBERG G R. 1987. Agricultural chemicals in ground water: extent and implications [J]. American Journal of Alternative Agriculture, 2(01): 3-15.

HAGGBLOM M M. 1990. Mechanisms of bacterial degradation and transformation of chlorinated monoaromatic compounds[J]. Journal of Basic Microbiol, 30: 115-141.

總而言之，深基坑項目時市政工程施工的重要組成部分，施工企業要對深基坑工程施工給予足夠的重視，做好對工藝的開發以及質量的控制，以此保證工程的順利進行和有效性。

HALLIN S, ROTHMAN M, Pell M. 1996. Adaptation of denitrifying bacteria to acetate and methanol in activated sludge[J]. Water Research, 30: 1445-1450.

KHAN S T, HORIBA Y, TAKAHASHI N, et al. 2007. Activity and community composition of denitrifying bacteria in poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) -using solid-phase denitrification processes[J]. Microbes and Environments, 22: 20-31.

MENASVETA P, PANRITDAM T, SIHANONTH P, et al. 2001. Design and function of a closed, recirculating seawater system with denitrification for the culture of black tiger shrimp broodstock[J]. Aquacultural Engineering, 25: 35-49.

MERGAERT J, BOLEY A, CNOCKAERT M C, et al. 2001. Identity and potential functions of heterotrophic bacterial isolates from a continuous-upflow fixed-bed reactor for denitrification of drinking water with bacterial polyester as source of carbon and electron donor[J]. Systematic and Applied Microbiology, 24: 303-310.

PRITCHARD P H , O'NEILL E J, SPAIN C M, et al. 1987. Physical and biological parameters that determine the fate of p-chlorophenol in laboratory test systems[J]. Applied and Environmental Microbiology, 53: 1833-1838.

SAIA F T, DAMIANOVIC M H R Z, CATTONY E B M. 2007. Anaerobic biodegradation of pentachlorophenol in a fixed-film reactor inoculatedwith polluted sediment from Santos-Sao Vicente Estuary, Brazil. Applied Microbiology and Biotechnology, 75: 665-672.

WANG X M, WANG J L. 2009. Removal of nitrate from groundwater by heterotrophic denitrification using the solid carbon source[J]. Science in China Series B-Chemistry, 52: 236-240.

WU W Z, YANG L H, WANG J L, et al. 2013. Denitrification performance and microbial diversity in a packed-bed bioreactor using PCL as carbon source and biofilm carrier[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 97: 2725-2733.

WU W Z, YANG L H, WANG J L, et al. 2013. Denitrification using PBS as carbon source and biofilm support in a packed-bed bioreactor[J]. Environmental Science and Pollution Research, 20: 333-339.

WANG X M, XING L J, QIU T L, et al. 2013. Simultaneous removal of nitrate and pentachlorophenol from simulated groundwater using a biodenitrification reactor packed with corncob[J]. Environmental Science and Pollution Research, 20: 2236-2243.

王旭明, 王建龍. 2009. 利用固相反硝化同時去除水中硝酸鹽和 4_氯酚[J]. 環境科學, 30(5): 1420-1424.

Simultaneous Removal of Nitrates and P-chlorophenol Using PHBV As Solid Phase Carbon Source

ZHAO Lan, WANG Ting, WU Weizhong*
College of Environmental Sciences and Engineering, Peking University, Beijing 100871, China

The co-existence of nitrate and pesticide in groundwater resulting from excessive application of fertilizers and pesticides has become one of potential health threats in China. Batch tests using PHBV as solid carbon source were conducted to simultaneously remove nitrate and p-chlorophenol and to further investigate the effect of p-chlorophenol on denitrification and microbial community. Results indicated that at 50 mg·L-1of NO3--N, addition of p-chlorophenol would lower overall removal of nitrate while improve denitrification rate after initial inhibition. At 10 mg·L-1of p-chlorophenol，averageremoval mainly due to biodegradation was found to be 45.4% over 24 hours and corresponding microbial community structure tended to diversity and evenness.

p-chlorophenol; NO3--N; solid-phase denitrification; solid carbon source; T-RFLP

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.02.018

X523

A

1674-5906（2015）02- 0300-05

趙蘭，王婷，吳為中. 以PHBV為固相碳源同時去除地下水中硝酸鹽氮和對氯苯酚的試驗研究[J]. 生態環境學報, 2015, 24(2): 300-304.

ZHAO Lan, WANG Ting, WU Weizhong. Simultaneous Removal of Nitrates and P-chlorophenol Using PHBV As Solid Phase Carbon Source [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(2): 300-304.

國家自然科學基金項目（51378021；50978001）；國家重大水專項（2012ZX07102002）

趙蘭（1989年生），女，碩士研究生，主要從事水污染治理技術方面的研究，E-mail: zhaolan0710@163.com *通訊聯系人：E-mail: wzwu@ pku.edu. cn

2014-12-27