短短芽孢桿菌降解芘的細胞毒性分析

廖麗萍，尹華，劉芷辰，葉錦韶，彭輝，劉則華

1. 暨南大學環(huán)境學院，廣東省高校水土環(huán)境毒害性污染物防治與生物修復重點實驗室，廣東 廣州 510632；2. 華南理工大學環(huán)境與能源學院，工業(yè)聚集區(qū)污染控制與生態(tài)修復教育部重點實驗室，廣東 廣州 5100062；3. 暨南大學化學系，廣東 廣州 510632

短短芽孢桿菌降解芘的細胞毒性分析

廖麗萍1，尹華2*，劉芷辰1，葉錦韶1，彭輝3*，劉則華2

1. 暨南大學環(huán)境學院，廣東省高校水土環(huán)境毒害性污染物防治與生物修復重點實驗室，廣東 廣州 510632；2. 華南理工大學環(huán)境與能源學院，工業(yè)聚集區(qū)污染控制與生態(tài)修復教育部重點實驗室，廣東 廣州 5100062；3. 暨南大學化學系，廣東 廣州 510632

近年來國內外對芘微生物降解過程中的菌種選育、降解性能和降解產(chǎn)物分析等相關報道較多，但針對芘降解菌與芘的分子作用機制研究卻不多見。為了探明降解菌短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）與芘的分子作用機制，考察了 B. brevis對質量濃度為1.0 mg·L-1的芘的生物降解，分析了在無機鹽培養(yǎng)基中B. brevis與芘作用過程中，其細胞凋亡規(guī)律及膜電位的變化，以期從細胞毒性的角度揭示PAHs的微生物降解機理。實驗結果顯示芘的降解率隨著處理時間的增加而呈上升趨勢，B. brevis對芘的降解率在168 h達到56.5%。在芘的降解過程中，細胞出現(xiàn)顯著的凋亡現(xiàn)象，細胞總凋亡率與細胞早期凋亡率均在48 h時達到峰值，之后均隨時間的延長而下降，168 h時細胞早期凋亡率與總凋亡率均小于0.5%，菌體依然對芘具有降解能力。隨著細胞凋亡的發(fā)生，細胞膜電位下降，即細胞膜電位發(fā)生去極化現(xiàn)象，說明細胞外的芘與 K+共轉運進入細胞內，從而有助于菌體對芘的吸收與降解。

芘；微生物降解；細胞凋亡；細胞膜電位

芘（pyrene）是多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)的四環(huán)代表物,屬難降解有機污染物（Lu等，2014），在環(huán)境中廣泛存在，可通過呼吸道、消化道、皮膚等途徑進入人體，破壞人體的免疫系統(tǒng)（Song等，2012），已被列入具有致癌性的PAHs之列。

微生物降解被認為是去除環(huán)境中PAHs的主要途徑，許多細菌、真菌、藻類及胞外聚合物具有降解PAHs的能力（Ashour等，2008；Chen 和Ding，2012；Whitman等，1997）。關于PAHs的微生物降解，目前主要側重于菌種選育、降解性能優(yōu)化和降解產(chǎn)物分析等方面（Balachandran等，2012；Chen等，2010；蔡翰等，2013）。對于PAHs微生物降解過程中降解菌與污染物的分子作用機制研究還有待深入。為了闡明PAHs微生物降解機理，對菌體降解PAHs過程細胞毒性的變化開展分析，有利于從生命代謝的角度揭示PAHs的降解機制。本研究利用課題組前期篩選的PAHs高效降解菌開展芘的微生物降解，考察降解菌與芘之間的相互作用，分析菌體降解芘過程中芘對菌體細胞毒性的影響，以期為更深入闡明PAHs微生物降解機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗菌種：芘降解菌短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）由本課題組于受多環(huán)芳烴污染的環(huán)境篩選獲得。

芘儲備液：用色譜純甲醇溶解芘，配制成 100 mg·L-1的儲備液，4 ℃保存待用。芘使用液：用儲備液配制成1.0 mg·L-1的使用液。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g·L-1)：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5。pH7.2～7.4。固體培養(yǎng)基加瓊脂1.5%～2.0%，用于菌株的分離富集及擴大培養(yǎng)。

無機鹽培養(yǎng)基(MSM)(mg·L-1)：K2HPO450，KH2PO430，MgSO4·7 H2O 10，檸檬酸鈉50。

磷酸鹽緩沖液(PBS)(g·L-1)：K2HPO40.24，Na2HPO41.44，NaCl 8.0，KCl 0.2，調節(jié)pH=7.4。

1.2 實驗方法

1.2.1 芘降解實驗

在滅菌無機鹽培養(yǎng)基中加入芘儲備液與菌液，配成20 mL降解體系，并使芘的濃度為1.0 mg·L-1，菌濃度為1.0 g·L-1。于30 ℃ 130 r·min-1避光處理，分別在第24、48、72、96、120、168 h取樣測定芘殘余量。以不加菌為空白對照。所有實驗做3個平行，取平均值計算，并根據(jù)平均值計算標準偏差SD。

降解率＝(對照組殘余量-樣品組殘余量)/對照組殘余量×100%

1.2.2 芘的分析方法

取出樣品后，用6.0 mol·L-1HCl調節(jié)pH至2，樣品轉入125 mL分液漏斗，加入等體積的乙酸乙酯萃取，充分混合后靜置分層，收集有機相。重復上述操作，萃取兩次，合并有機相，過無水硫酸鈉，收集于梨形瓶中，用旋轉蒸發(fā)儀于 35 ℃蒸干，最后用流動相洗滌濃縮定容至 10 mL，利用 HPLC（LC-20A，日本島津）進行芘檢測。檢測條件：分離柱為InertsilODSSP C18柱（5 μm、4.6×250 mm）；使用紫外檢測器，檢測波長254 nm；流動相V甲醇∶V水=90∶10，流速為1 mL·min-1；保留時間為4.8 min；進樣量20 μL。芘的檢測限為5 μg·L-1。

1.2.3 B. brevis 降解芘過程中細胞凋亡檢測

離心收集處理芘24、48、72、96、120、168 h的菌體，利用15.0 mg·L-1溶菌酶去除細胞壁，PBS重懸，離心收集原生質體，通過稀釋使細胞濃度約為106個·mL-1。加入200 μL Binding Buffer重懸后用10 μL Annexin V-FITC染色，室溫避光反應10 min；6000 r·min-1離心5 min收集沉淀，用200 μL Binding Buffer重懸后加入 10 μL 碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）避光染色，用流式細胞儀檢測。流式細胞儀激發(fā)波長為425 nm，異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）的熒光檢測波長為525 nm，PI的檢測波長為630 nm。以不加污染物為對照組，對照組菌體分出200 μL不染色作空白參照。

1.2.4 B. brevis 降解芘過程中細胞膜電位檢測

收集培養(yǎng)24、48、72、96、120、168 h的菌體，PBS重懸，稀釋樣品使細胞濃度約為106個·mL-1。加 入 200 μL Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide(JC-1)37 ℃避光染色15 min，用流式細胞儀檢測。流式細胞儀的激發(fā)波長為 488 nm，JC-1的熒光檢測波長為530和590 nm。以不加芘為對照組。

2 結果與討論

2.1 芘的降解

芘在MSM體系中的降解情況如圖1所示，在MSM 體系中，芘的降解率隨著處理時間的增加而呈上升趨勢。24 h時，B. brevis對芘的降解率只有3.0%，這主要是由于菌體要通過細胞壁的吸附、跨膜運輸?shù)茸饔貌拍馨衍欧e累到細胞內（Ye等，2014），該運輸過程緩慢，導致細胞內降解酶與芘的接觸機會較少（葉錦韶等，2010）。當降解時間為48～96 h時，芘的降解速率較快，降解率顯著提高，胞內酶在該階段起了主要的作用。120～168 h時，菌體對芘的降解速率開始下降，但菌體對芘依然具有降解能力，168 h時芘的降解率達到56.5%。這個階段細胞壁和細胞膜的結構因芘的作用而發(fā)生了改變，部分胞內物質流失（蔡翰等，2013），但細胞并未失去活性，細胞仍能產(chǎn)生相應的酶對芘進行分解利用。

圖1 B. brevis對芘的降解Fig. 1 Pyrene biodegradation by B. brevis

2.2 B. brevis 降解芘過程中細胞凋亡規(guī)律

為了進一步研究在芘的降解過程中菌體活性的變化，運用流式細胞術測定了菌體細胞的凋亡變化。細胞凋亡早期的變化發(fā)生在細胞膜表面，細胞膜表面的變化之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞膜內側轉移到細胞膜外。Annexin V是一種分子量為35～36 kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，可通過細胞外側暴露的PS與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將 Annexin V進行 FITC標記，以標記了的Annexin V作為熒光探針，利用流式細胞儀可檢測細胞早期凋亡的發(fā)生。PI是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，可將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來（Qin等，2015）。

圖2為菌體降解芘48 h時的細胞凋亡散點圖，其中Q1表示既與PI作用，也與Annexin V作用的粒子，主要指壞死細胞；Q2表示與PI作用，但不與 Annexin V作用的粒子，即晚期凋亡細胞；Q3表示既不與PI作用，也不與Annexin V作用的粒子，即活細胞；Q4表示不與PI作用，但與Annexin V作用的粒子，指早期凋亡細胞。從圖2可以看出，在芘的脅迫下，部分細胞處于Q2（晚凋）和Q4（早凋）區(qū)，發(fā)生自身凋亡，細胞膜基團發(fā)生改變。

圖3為芘降解過程中細胞早期凋亡率與細胞總凋亡率隨時間的變化情況。B. brevis降解芘20～48 h時，細胞的早期凋亡率顯著增多，且明顯大于空白對照組。48 h達到峰值；隨后48～96 h，細胞的早期凋亡率顯著減少；96～168 h，凋亡速率放緩。該結果表明在降解過程中，芘能夠誘導菌體細胞的凋亡。在芘的脅迫下，菌體出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，細胞表面基團發(fā)生了變化，表面疏水性增強（Li和 Zhu，2012），同時使細胞表面的芘進入細胞內。通過胞內酶的作用，芘逐漸被降解。同時，細胞的凋亡會造成胞內核酸酶的釋放，核酸酶將遺傳物質分解成小的片段，DNA的變化使得調控菌體降解的某些功能蛋白被表達或表達量增多（Wu等，2009），也促進了菌體對芘的降解作用。故48～96 h時，菌體對芘的降解速率較快。120 h時，細胞早期凋亡率與總凋亡率均顯著減小，168 h時細胞早期凋亡率與總凋亡率均小于0.5%。該結果表明隨著菌體對環(huán)境的適應，菌體能夠利用凋亡細胞流出的離子、蛋白、糖類等胞內物質以及芘作為能源，進行生長代謝（Chen等，2010；葉錦韶等，2014），使活性菌體的比例逐漸增多，因此菌體依舊能夠產(chǎn)生與降解有關的酶，對殘留的芘進行降解。

圖2 B. brevis降解芘48 h時的細胞凋亡散點圖Fig. 2 Cell apoptosis scatter plot of B. brevis after pyrene degradation for 48 h

圖3 B. brevis降解芘過程中細胞凋亡的變化Fig. 3 Change of bacterium apoptosis during pyrene degradation

2.3 B. brevis降解芘過程中細胞膜電位的變化

在細胞凋亡的過程中往往伴隨著跨膜電位的破壞，這被認為是細胞凋亡過程中最早發(fā)生的現(xiàn)象之一。熒光探針 JC-1是一種陽離子型的親脂性染料，能夠自由穿過細胞膜，與胞漿結合。膜電位高時，JC-1通過細胞膜極性進入細胞體內，并因濃度升高而形成發(fā)射紅色熒光的多聚體；膜電位降低時，發(fā)生去極化現(xiàn)象，JC-1從細胞體內釋放，濃度降低，逆轉為發(fā)射綠色熒光的單體形式。故而通過綠色和紅色熒光強度的比值可定量檢測細胞膜電位的變化（Qin等，2014）。

菌體降解芘過程中細胞膜電位隨時間的變化如圖4。從圖中可以看出，第24～96 h期間，細胞膜電位呈快速的下降趨勢，且明顯小于對照組。該結果表明，在芘的降解過程，細胞膜電位發(fā)生去極化現(xiàn)象。研究表明，細胞膜電位的變化與細胞內外Na+、K+的變化密切相關（Volkov等，2011）。細胞發(fā)生凋亡時，細胞膜的完整性被破壞，細胞膜通透性增大（Chen等，2014），細胞內的Na+逐漸釋放到細胞外，細胞外的K+不斷通過K+-ATP酶離子泵運輸?shù)郊毎麅龋毎麅雀逰+、低 Na+，造成細胞外環(huán)境為高Na+、低K+（何寶燕等，2007），從而導致細胞膜電位下降。芘是一個不帶電荷的分子，可與胞外K+共轉運進入細胞內，因此，膜電位的去極化促進細胞對芘的吸收與降解（Yin等，2014）。120 h后，細胞內外的Na+、K+處于平衡狀態(tài)，故膜電位去極化程度減弱，菌體對芘的吸收與降解速率也減緩。

圖4 B. brevis降解芘過程中細胞膜電位的變化Fig. 4 Change of membrane potential during pyrene degradation by B. brevis

3 結論

（1）B. brevis對芘的降解率在168 h達到56.5%。

（2）在芘的降解過程中，細胞出現(xiàn)顯著的凋亡現(xiàn)象，促進了菌體對芘的降解。168 h時細胞早期凋亡率與總凋亡率均小于0.5%，菌體依然對芘具有較強的降解能力。

（3）隨著細胞凋亡的發(fā)生，細胞膜電位發(fā)生去極化現(xiàn)象，促進了細胞對芘的吸收與降解。

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Cytotoxicity Assay of Pyrene Biodegradation by Brevibacillus brevis

LIAO Liping1, YIN Hua2*, LIU Zhichen1, YE Jinshao1, PENG Hui3*, LIU Zehua2
1. Key Laboratory of Water/Soil Toxic Pollutants Control and Bioremediation of Guangdong Higher Education Institutes, School of Environment, Jinan University, Guangzhou 510632, China; 2. Key Laboratory of Ministry of Education on Pollution Control and Ecosystem Restoration in Industry Clusters, School of Environment and Energy, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China; 3.Department of Chemistry, Jinan University, Guangzhou 510632, China

Although there have been many reports on the isolation of pyrene degrading stains, pyrene degradation characteristics and its catabolites, the information regarding molecular mechanism between degrading bacteria and pyrene is limited thus far. To explore the molecular mechanism between degrading bacterium Brevibacillus brevis and pyrene, the biodegradation of pyrene (1.0 mg·L-1) by B. brevis, as well as the cell apoptosis and changes of membrane potential of B. brevis under pyrene exposure in mineral salt medium (MSM) was conducted to reveal the mechanism of pyrene biodegradation from the perspective of cytotoxicity. The experimental results showed that pyrene degradation efficiency increased with time. And the biodegradation efficiency of pyrene by B. brevis reached 56.5% after 168 h. In the degradation process, pyrene significantly induced the cell apoptosis. Both the total percentage of apoptotic cells and the percentage of apoptotic cells in the early stage reached their peak values on the 48th h, and decreased thereafter with the extension of time. The total percentage of apoptotic cells and the percentage of apoptotic cells in the early stage were all less than 5% at 168 h, which revealed that B. brevis at this stage still had degradation capability for pyrene. Moreover, as the apoptosis occurred, cell membrane potential declined evidently, which meant that cell membrane potential was depolarized. This result implied that extracellular pyrene and K+co-transported into the cells, thus promoting the uptake and degradation of pyrene.

pyrene; biodegradation; cell apoptosis; membrane potential

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.03.020

X171.5

A

1674-5906（2015）03-0501-04

廖麗萍，尹華，劉芷辰，葉錦韶，彭輝，劉則華. 短短芽孢桿菌降解芘的細胞毒性分析[J]. 生態(tài)環(huán)境學報, 2015, 24(3): 501-504.

LIAO Liping, YIN Hua, LIU Zhichen, YE Jinshao, PENG Hui, LIU Zehua. Cytotoxicity Assay of Pyrene Biodegradation by Brevibacillus brevis [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(3): 501-504.

國家自然科學基金委-廣東省聯(lián)合基金重點項目（U0933002）；廣東省自然科學基金重點項目（S2013020012808）

廖麗萍（1988年生），女，碩士研究生，主要研究方向為水污染控制與修復。E-mail：feather66@126.com *通訊聯(lián)系人：尹華（1960年生），女，教授，博士生導師。研究方向：持久性有機污染物的治理與生物修復。E-mail：huayin@scut.edu.cn；tbpenghui@163.com

2015-01-22