人骨髓間質干細胞誘導成骨分化過程中差異表達蛋白的鑒定和分析*

張愛霞，余偉華，王濤，馬保鋒

（1.嘉應學院生命科學學院生物工程系，廣東 梅州 514015；2.中山大學中山醫學院干細胞與組織工程中心，廣東 廣州 510080）

·論著·

人骨髓間質干細胞誘導成骨分化過程中差異表達蛋白的鑒定和分析*

張愛霞1，余偉華2，王濤1，馬保鋒2

（1.嘉應學院生命科學學院生物工程系，廣東 梅州 514015；2.中山大學中山醫學院干細胞與組織工程中心，廣東 廣州 510080）

目的探討人骨髓間質干細胞（hMSCs）誘導成骨分化過程中的差異表達的蛋白點，為闡明hMSCs成骨分化的分子機制提供依據。方法收集hMSCs和成骨誘導7 d的細胞全蛋白，應用雙向凝膠電泳和圖像分析軟件進行蛋白質點的識別和檢測，應用比較蛋白質組學技術找出凝膠上的差異蛋白點,應用基質輔助激光解析離子化飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）和生物信息學方法對差異蛋白點進行蛋白質的鑒定和分析。結果通過MALDI-TOF-MS和生物信息學方法鑒定出了52種差異蛋白質，其中13種蛋白質在成骨誘導7 d后表達明顯上調，39種蛋白質在成骨誘導7 d后表達明顯下調；利用Gene Ontology對這些蛋白質按生物學過程和分子功能進行了分析。結論鑒定了52種可能在hMSCs誘導成骨分化過程中發揮重要作用蛋白質，這為進一步揭示hMSCs成骨分化的分子機制提供了科學依據。

骨髓間質干細胞；成骨分化；蛋白質組學

骨髓間質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有很強的自我更新能力和多向分化潛能[1]，研究表明MSCs在骨損傷的修復中起重要作用[2]。MSCs已成為重要的組織工程種子細胞，并且MSCs的細胞增殖分裂模式使外源基因易于導入和表達。因此，成為潛在細胞替代治療、基因治療的靶細胞。目前對間充質干細胞的研究也越來越深入，同時取得了很多可喜的成績。但是MSCs的成骨分化的確切機制尚未闡明。

本研究利用體外定向誘導人骨髓間質干細胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hMSCs）分化為成骨細胞的模型和蛋白組學技術，研究hMSCs分化為成骨細胞過程中成骨相關蛋白的表達，對于闡明MSCs分化為成骨細胞的分子機制具有重要意義，也將為臨床上治療骨質疏松、難治性骨損傷等奠定初步的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑

hMSCs來自中山大學中山醫學院干細胞與組織工程中心，L-DMEM培養基、H-DMEM培養基均購自美國Gibco BRL公司，Vitamin C、地塞米松購自美國Sigma公司，β-甘油磷酸鈉購自美國Calbiochem公司，溴酚藍、十二烷基磺酸鈉、固相pH梯度膠條（pH 3～10，線性）、蛋白質純化試劑盒及蛋白質定量試劑盒等均購自瑞典Amersham Biosciences公司。

1.2儀器

倒置顯微鏡（IX71-22FL/PH，日本OLYMPUS公司），超凈工作臺（NU-301-630E，美國NUARIE公司），等電聚焦電泳系統（Ettan IPGphorⅡ，瑞典Amersham Biosciences公司）、垂直電泳系統（Ettan DALTsix，瑞典Amersham Biosciences公司）、掃描儀（Typhoon9400，瑞典Amersham Biosciences公司）、圖像分析軟件（Image MasterTM 2-D Platinum software 5.0，瑞典Amersham Biosciences公司）、全自動斑點處理工作站（Ettan Spot Handing Workstation，瑞典Amersham Biosciences公司）、基質輔助激光解析離子飛行時間質譜分析儀（Ettan MALDI-TOF Pro Mass Spectrometry，瑞典Amersham Biosciences公司）等。

1.3方法

1.3.1hMSCs體外定向誘導分化為成骨細胞及鑒定

將傳代擴增后至第5代的hMSCs接種于六孔板，實驗組每孔加入成骨細胞誘導液（含10-7mol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，50μg/ml Vitamin C）2 ml；對照組每孔加入L-DMEM完全培養液，置培養箱中。堿性磷酸酶染色：取成骨細胞誘導分化第10天的細胞，4%多聚甲醛固定15 min，加入適量堿性磷酸酶染色液在室溫下孵育10～20 min，顯微鏡下觀察染色的結果。鈣結節染色：取上述誘導分化第18天的細胞，加入適量的茜素紅-S染色10～15 min，顯微鏡下觀察結果。

1.3.2蛋白樣品的制備、雙向凝膠電泳及圖像分析加入裂解液裂解hMSCs及誘導成骨分化7 d的細胞，超聲波處理，20000 g，4℃離心30 min，取上清液。按蛋白質純化試劑盒說明書方法純化蛋白后，使用蛋白質定量試劑盒，按照說明書方法，對蛋白濃度進行定量。將蛋白樣品進行第一向等電聚焦電泳后，將膠條轉移至12.5%濃度的SDS-PAGE膠面上進行第二向電泳，直至膠內電泳指示劑溴酚藍跑出凝膠下緣10 min后，對凝膠進行熒光染色。用掃描儀對熒光染色的凝膠進行掃描后，利用圖像分析軟件進行雙向凝膠電泳（Two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）圖像分析，通過背景消減、斑點檢測等，建立hMSCs和誘導成骨分化7 d的凝膠圖像，選取ratio≥2.0的差異表達候選蛋白，進行質譜鑒定和生物信息學分析。

1.3.3質譜鑒定和生物信息學分析使用全自動斑點處理工作站對差異蛋白斑點自動進行切割、脫色、干燥、酶解、加入基質和質譜靶點樣等一系列操作。將點好的質譜靶放入質譜儀，激光源為337 nm波長的氮氣激光器，獲得樣品的肽質量指紋圖譜。質譜數據的分析使用Profound軟件檢索，以MASCOT為搜索引擎在人的NCBInr和Swiss-prot數據庫中進行搜索。對所鑒定出的蛋白，依據Gene Ontology的生物過程和分子功能分別對它們分類分析，并繪制成圖。

2 結果

2.1hMSC成骨誘導分化過程中的形態變化及成骨誘導分化的鑒定

在鐵路工程連續梁橋的施工控制中，自適應控制方法也是鐵路工程連續橋梁施工控制中的重要方法之一。該方法在現階段鐵路工程連續橋梁施工中的應用是最為普遍的，主要是對計算參數進行分析，將分析后的參數結果與實際參數加以對比，了解參數偏差。在此基礎上，對參數進行估計與修正，將修正和識別后的參數，應用到下階段的實時結構分析與往復循環中。經過多個鐵路工程連續橋梁的施工階段，得到的參數取值會最大限度地趨于合理，且軟件模擬計算結果也會與鐵路工程連續橋梁施工的實際情況相適應。一般來說，連續橋梁的自適應控制法多應用于大跨度結構的連續橋梁施工中，且是在閉環控制方法基礎上展開的。

hMSCs加入成骨誘導液后，可見部分細胞由長梭形逐漸變為多角形，體積增大。隨著培養時間的延長，這種多角形細胞逐漸增多。隨著成骨誘導的進行，細胞持續增殖，開始呈多層重疊生長，細胞之間界限模糊，細胞逐漸聚集形成多個散在的島狀細胞結構，此島狀細胞結構逐漸被分泌的基質所包埋，13～14 d左右出現鈣結節，有明顯的鈣沉積。對照組加入L-DMEM完全培養液，細胞增殖良好，形態不變，不見致密的島狀細胞結構和鈣化結節。見圖1。

在誘導培養的第10天，進行堿性磷酸酶染色，實驗組可觀察堿性磷酸酶染色反應為強陽性，細胞密集區出現紫黑色顆粒，胞漿內有紫黑色的顆粒沉淀；對照組堿性磷酸酶染色陰性或弱陽性反應，見圖2。在成骨細胞誘導培養2周后用茜素紅-S檢測鈣沉積的情況，實驗組鏡下可見散在大量橘紅色的鈣結節，為茜素紅與鈣鹽形成的橘紅色的復合物，對照組結果為陰性，見圖3。

2.2hMSCs及誘導成骨分化7 d的總蛋白的雙向凝膠電泳及其質譜鑒定

軟件分析結果顯示，3張hMSCs和3張誘導成骨分化7 d的雙向凝膠電泳圖譜蛋白質斑點匹配率均達到75%以上，膠的重復性好，蛋白點的分子量主要集中在20～80 kD之間，等電點主要分布在pH 4.0～8.0之間，蛋白點分離良好。

篩選ratio≥2.0的差異表達候選蛋白，經過膠內酶切和多肽提取后，進行質譜鑒定，70多個蛋白質點成功的獲得了肽質量指紋圖譜。

2.3生物信息學分析

通過數據庫搜索，共鑒定出52種差異蛋白質，其中13種蛋白質在成骨誘導7 d后表達明顯上調，39種蛋白質在成骨誘導7 d后表達明顯下調。附表列出了這些蛋白質的相關信息，其中后35種蛋白在相關文獻中已有報道[3]，從左到右依次是數據庫登入號、蛋白質名稱及表達情況：上調/下調（U/D）。

圖1 hMSCs的體外成骨分化的細胞形態學觀察（×40）

附表 52種差異蛋白的鑒定結果

按照Gene Ontology的分類方式對所有鑒定的蛋白質分類繪圖，生物學過程分類中發現參與體內代謝和發育過程的蛋白質分別占37%和31%，分子功能分類中發現具有催化活性和結合功能的蛋白質分別占37%和27%，見圖4。

圖2 hMSCs體外成骨分化的堿性磷酸酶染色（×100）

圖3 hMSCs體外成骨分化的茜素紅-S染色（×100）

圖4 按照Gene Ontology的分類方式對所有鑒定的蛋白質進行分類

3 討論

蛋白質組學方法己被廣泛應用于各種組織細胞的生理病理的分子特征的分析[4-5]，本研究通過高分辨率的雙向電泳技術、質譜分析以及生物信息學技術，成功的鑒定出52種差異蛋白，一些可能是在成人骨髓間質干細胞誘導成骨分化過程中起關鍵作用的新蛋白。

本研究鑒定出的多種蛋白中，一些是已知的與骨發育有關的蛋白，如Annexin A2和Annexin V，研究表明，Annexin A2和Annexin V對于啟動成骨的礦化過程有著至關重要的作用[6]。Annexin A2與成骨必需的堿性磷酸酶位于細胞膜上的同一脂筏中，Annexin A2能增強堿性磷酸酶的活性，從而有利于成骨的礦化，如果抑制Annexin A2的表達則減弱了成骨的礦化過程[7]。GENETOS等研究發現，Annexin A2和Annexin V可通過調節成骨前體細胞的增殖、分化以及對細胞因子的反應而影響成骨過程[8]。成骨細胞表達Annexin A2，對于移植造血干細胞在骨髓微環境的黏附、歸巢及遷移起到重要的調節作用[9]。研究發現，ERK信號傳導通路在成骨分化過程中有重要作用[10-11]，而ERK信號通路可激活Annexin A2的表達[12]，可能在成骨過程中，成骨誘導劑通過ERK信號通路而作用與Annexin A2，從而使成骨過程順利進行。

本研究鑒定的蛋白中，一些是與分化發育有關的蛋白，如胞內氯離子通道蛋白4（chloride intracellular channel protein 4，CLIC4），研究表明，CLIC4參與內皮增殖及內皮與上皮的形態建成[13-14]，抑制CLIC4的表達將導致細胞的凋亡[15-16]，在肌纖維母細胞的分化中，CLIC4通過p38信號通路調節此分化過程[17]，而p38信號轉導通路在成骨分化中發揮重要的作用[18-19]，hMSCs成骨誘導分化過程中，細胞的數量也在不斷增加，CLIC4可能有助于細胞增殖以及通過p38信號轉導通路而調節hMSCs成骨分化的過程。另外，新生多肽相關復合體α多肽的下調表達在hMSCs成骨分化中可能起重要作用，研究表明，caspases能促進成骨分化[20]，caspases的激活需要Fas相關死亡域蛋白（fas-associated with death domain protein，FADD）的參與，而新生多肽相關復合體α多肽與FADD的結合抑制了FADD的二聚體形成，從而抑制caspases的表達[21]，在本試驗中，新生多肽相關復合體α多肽的表達下調，可能通過調節FADD的二聚體形成、增強caspases的表達進而促進成骨分化過程。對于所鑒定出的蛋白的具體作用機制還有待于進一步的實驗研究。

本研究獲得了大量與成人骨髓間質干細胞誘導成骨分化相關的新信息，初步建立了hMSCs誘導成骨分化的差異表達蛋白質數據庫，為進一步揭示間質干細胞誘導成骨分化的機制提供了新的思路。

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（王榮兵 編輯）

Identification and analysis of differential expressed proteins in osteoblast differentiation from human bone marrow mesenchymal stem cells*

Ai-xia ZHANG1,Wei-hua YU2,Tao WANG1,Bao-feng MA2
(1.Department of Biological Engineering,College of Life Sciences,Jiaying University,Meizhou, Guangdong 514015,P.R.China;2.Center for Stem Cell and Tissue Engineering,Zhongshan School of Medicine,Sun Yat-sen University,Guangzhou,Guangdong 510080,P.R.China)

【Objective】To research human bone marrow mesenchymal stem cells(hMSCs)differentiation along osteoblasts to find the important functional proteins and elucidate the molecular mechanism in the process of differentiation into osteoblasts.【Methods】The total protein extracts were obtained with cell lysis buffer from undifferentiated hMSCs and osteogenic induced hMSCs on day 7.Using proteomic approaches based on two-dimensional gel electrophoresis(2-DE)and 2-DE gel analysis software,differently expressed protein spots were selected after being recognized and tested.The selected differently expressed protein spots were identified and analyzed by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS)and bioinformatics.【Results】Through MALDI-TOF-MS analysis and database searching,52 proteins were identified including 13 up-regulated and 39 down-regulated in osteogenic induced hMSC for 7 days relative to undifferentiated hMSCs.The identified proteins were grouped by Gene Ontology according to biological process and molecular function.【Conclusion】The identified differential proteins that maybe play important roles in osteogenic differentiation of hMSCs provide a comprehensive reference to understand molecular mechanism of osteogenic differentiation.

human bone marrow mesenchymal stem cells;osteogenic differentiation;proteomics

R329.2

A

1005-8982（2015）25-0016-05

2014-12-20

國家自然科學基金資助項目（No：81000681；No：81000177）