Th17細(xì)胞在支氣管哮喘小鼠發(fā)病機(jī)制中的作用研究

單世民，毛毅敏，孫瑜霞

（河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 洛陽 471000）

·論著·

Th17細(xì)胞在支氣管哮喘小鼠發(fā)病機(jī)制中的作用研究

單世民，毛毅敏，孫瑜霞

（河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 洛陽 471000）

目的研究Th17細(xì)胞及其分泌的炎癥因子（IL-17）在哮喘小鼠氣道炎癥中的作用機(jī)制，并初步探討Th17和T-reg細(xì)胞的表達(dá)失衡的意義。方法將30只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，采用卵白蛋白（OVA）致敏的方法建立小鼠哮喘模型。對(duì)兩組小鼠肺泡灌洗液（BALF）中炎癥細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)BALF中IL-17和IL-10水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血Th17和T-reg細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞百分率情況；并分析Th17和T-reg細(xì)胞數(shù)與BALF中性粒細(xì)胞的相關(guān)性。結(jié)果哮喘組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞百分率均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。哮喘小鼠外周血Th17/T-reg細(xì)胞比例增大；BALF上清中IL-17水平明顯升高，而IL-10水平明顯降低（均P＜0.05）。Th17細(xì)胞數(shù)與BALF中的中性粒細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)，而T-reg細(xì)胞數(shù)與BALF中的中性粒細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論Th17及其分泌的炎癥因子IL-17在哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)中有著重要作用，同時(shí)Th17/T-reg細(xì)胞在小鼠哮喘模型中失衡表達(dá)，提示其參與了哮喘的發(fā)病過程，為治療哮喘提供新的研究思路。

支氣管哮喘；Th17；IL-17；T-reg

支氣管哮喘是一種常見的慢性肺部疾病，其發(fā)病率和死亡率在我國(guó)逐年增高，但其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。目前認(rèn)為Th1/Th2細(xì)胞失衡導(dǎo)致Th2細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)是哮喘發(fā)病最重要的免疫學(xué)機(jī)制[1]，但近年來的一些實(shí)驗(yàn)和臨床現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2失衡理論并不能完全解釋哮喘的發(fā)病過程[2]。最近的研究表明Th17細(xì)胞作為一類新發(fā)現(xiàn)的輔助性T細(xì)胞，它在哮喘的發(fā)生及發(fā)展過程中具有重要的作用，而CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T-reg細(xì)胞）亦可能參與了哮喘的發(fā)生過程[3]。在Th17細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子中，最重要的是白細(xì)胞介素-17（interleukin-17，IL-17），而T-reg細(xì)胞分泌最常見的細(xì)胞因子是白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）[4]。本研究通過觀察哮喘小鼠模型中Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17在小鼠體內(nèi)的變化情況，初步探討Th17和T-reg的表達(dá)失衡在哮喘小鼠發(fā)病機(jī)制中的作用，為臨床治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試劑及儀器

卵蛋白（ovalbumin，OVA，美國(guó)Sigma公司），ELISA測(cè)定試劑盒（深圳晶美生物公司），RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，抗小鼠單克隆抗體及其同型對(duì)照均購(gòu)自美國(guó)BD/Pharmingen公司，酶標(biāo)儀（美國(guó)PerkinElmer公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)R&D），光學(xué)顯微鏡（德國(guó)Leica公司），超聲波霧化器（WH 22000型，廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司）。

1.2動(dòng)物分組及小鼠哮喘模型模型建立

實(shí)驗(yàn)小鼠為SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，體重18～20 g，隨機(jī)將30只小鼠分為正常對(duì)照組和哮喘模型組，每組各15只。哮喘組于實(shí)驗(yàn)開始當(dāng)天和第8天分別給予腹腔內(nèi)注射OVA混懸液（含OVA/Al（OH）3為10 mg/g），每次50μg，第16天開始給予霧化吸入含1%OVA的生理鹽水40 ml，40 min/d，連續(xù)7 d[3]。對(duì)照組以等量的生理鹽水代替OVA，觀察兩組小鼠反應(yīng)和肺功能變化情況。

1.3支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）的收集及制備

兩組小鼠在最后1次激發(fā)24 h后固定，處死小鼠并打開胸腔對(duì)小鼠行氣管插管，結(jié)扎左側(cè)主支氣管，用4℃磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）行支氣管肺泡灌洗3次，每次3 ml，回收率在80%以上為合格。對(duì)收集液進(jìn)行離心（4℃，1 000 r/min，5 min）后取上清液，-80℃保存?zhèn)溆谩⒒厥盏腂ALF涂片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)細(xì)胞總數(shù)和分類進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4外周血及BALF上清中IL-17和IL-10檢測(cè)

外周血通過摘眼球獲得，離心收集上清，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｓ肊LISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定外周血和BALF中IL-10和IL-17水平，具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Th17及細(xì)胞

外周血通過摘眼球采取，肝素化處理，加入適當(dāng)?shù)哪芫匾海糜?0 ml/L二氧化碳CO2、37℃孵育箱培養(yǎng)5 h，加入10μl相應(yīng)抗體及其相匹配的同型對(duì)照，室溫避光孵育30 min，PBS洗2次，并用0.5 ml PBS重懸檢測(cè)，CellQuest軟件分析細(xì)胞數(shù)量情況。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較分析采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1肺功能分析

與對(duì)照組相比，哮喘模型組小鼠先后出現(xiàn)咳嗽、氣急、呼吸頻率加快和毛發(fā)倒伏等癥狀，模型組小鼠吸氣阻力（inspiratory resistance，Ri）與呼氣阻力（expiratory resistance，Re）均明顯增加（P＜0.05），肺順應(yīng)性下降。見表1。

表1 經(jīng)OVA激發(fā)后兩組小鼠氣道阻力及肺順應(yīng)性比較（[cmH2O·s）/ml±s]

表1 經(jīng)OVA激發(fā)后兩組小鼠氣道阻力及肺順應(yīng)性比較（[cmH2O·s）/ml±s]

注：?與對(duì)照組相比，P＜0.05

組別RiReCdyn對(duì)照組（n=15）1.8±0.13.5±1.60.16±0.02哮喘組（n=15）3.2±0.2?5.7±0.9?0.11±0.01?

2.2BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類

哮喘組小鼠的BALF中細(xì)胞總數(shù)和各炎癥細(xì)胞的百分率均明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

2.3Th17細(xì)胞和T-reg細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果

哮喘組小鼠外周血Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比高于對(duì)照組，而T-reg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比低于對(duì)照組（均P＜0.05）。哮喘組小鼠存在Th17/T-reg比例失衡，且比值明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)果見表3與附圖。

附圖 對(duì)照組與模型組小鼠Th-17細(xì)胞和T-reg細(xì)胞所占比例（%）

表2 兩組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞分類比較（n=15±s）

表2 兩組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞分類比較（n=15±s）

注：?與對(duì)照組相比，P＜0.05

組別細(xì)胞總數(shù)/（×105個(gè)/ml）嗜酸性細(xì)胞/%中性粒細(xì)胞/%淋巴細(xì)胞/%對(duì)照組0.7±0.22.8±1.05.2±1.37.8±2.7哮喘組3.4±0.1?26.3±4.0?31.5±4.0?22.7±4.1?

表3 小鼠外周血TH17及Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比率（±s）

表3 小鼠外周血TH17及Treg細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比率（±s）

注：?與對(duì)照組相比，P＜0.05

組別Th17細(xì)胞/%T-reg細(xì)胞/%Th17/T-reg對(duì)照組2.8±0.97.9±2.40.5±0.2哮喘組9.2±1.3?2.7±0.6?3.5±0.3?

2.4兩組小鼠BALF中IL-17與IL-10水平的檢測(cè)哮喘組BALF和血清中IL-17水平明顯升高，與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。哮喘組BALF和血清中IL-10水平明顯下降，與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表4。

表4 兩組小鼠肺泡灌洗液和血清中IL-10和IL-17水平（pg/ml±s）

表4 兩組小鼠肺泡灌洗液和血清中IL-10和IL-17水平（pg/ml±s）

注：?與對(duì)照組相比，P＜0.01

組別IL-10IL-17 BALF血清BALF血清對(duì)照組（n=8）108.1±13.1 131.4±3.55.3±0.35.8±0.8哮喘組（n=8）29.3±12.8?33.2±14.8?11.3±2.4?22.2±3.9?

2.5相關(guān)性分析

哮喘組小鼠外周血Th17細(xì)胞數(shù)與BALF中的中性粒細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)（r=0.421，P＜0.05），T-reg細(xì)胞數(shù)與BALF中的中性粒細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)（r= -0.533，P＜0.05）。

3 討論

支氣管哮喘是一種與免疫功能紊亂有關(guān)的慢性氣道炎癥性疾病，長(zhǎng)期以來，Th1/Th2失衡理論在哮喘發(fā)病機(jī)制中占主導(dǎo)地位。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞是一種新型的不同于Th1和Th2，獨(dú)立分化和發(fā)育的另一種輔助性T細(xì)胞（Th17）亞群，與哮喘密切相關(guān)[5]。該細(xì)胞由天然T細(xì)胞前體Th0分化而來，在促炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病中有著重要作用[6]。該細(xì)胞亞群能夠特異性地產(chǎn)生效應(yīng)因子IL-17，而不產(chǎn)生干擾素-γ和IL-4。因此，被稱為Th17亞群[7]。Th1和Th2細(xì)胞因子能夠調(diào)控Th17細(xì)胞亞群的分化，IL-6和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）聯(lián)合作用能誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化成Th17細(xì)胞[8]，這些機(jī)制表明Th17細(xì)胞在哮喘的發(fā)病中同樣具有一定作用。

Th17分泌的IL-17是T細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的早期啟動(dòng)因素，它是強(qiáng)大的促炎細(xì)胞因子，其主要的促炎機(jī)制是促進(jìn)多種細(xì)胞（如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞）釋放炎性（如IL-6、IL-8、粒細(xì)胞集落刺激因子以及前列腺素E2）而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[9]。T-reg細(xì)胞的作用機(jī)制主要包括通過分泌細(xì)胞因子IL-10和TGF-β直接介導(dǎo)免疫抑制，其中，細(xì)胞因子IL-10具有抗炎作用，既可抑制促炎細(xì)胞因子的合成，亦可抑制嗜酸粒細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞的致炎，F(xiàn)oxp3是調(diào)控T-reg的標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子[10]。有研究表明，哮喘小鼠外周血中的T-reg細(xì)胞顯著低于正常小鼠[11]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示T-reg細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子IL-10水平低于正常小鼠。

本研究中，哮喘組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等均明顯增高，以及Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-17的水平亦較正常對(duì)照組明顯升高，同時(shí)哮喘組小鼠外周血Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例較對(duì)照組小鼠明顯升高，表明Th17及其分泌的炎癥因子參與了哮喘的發(fā)病過程。IL-17可增強(qiáng)IL-1及腫瘤壞死因子的功能，誘導(dǎo)IL-6及IL-8的產(chǎn)生，增強(qiáng)I-CAM-1在細(xì)胞表面的表達(dá)。因此，IL-17是T細(xì)胞調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞參與哮喘炎癥反應(yīng)的中介；另外IL-17還具有上調(diào)黏液基因表達(dá)促進(jìn)黏液分泌的作用，并可間接促進(jìn)氣道組織纖維化而參與哮喘的氣道重塑過程。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在哮喘小鼠中Th17細(xì)胞比例明顯高于正常組小鼠的同時(shí)，T-reg細(xì)胞比例則明顯減少，同時(shí)T-reg細(xì)胞所分泌的相關(guān)細(xì)胞因子IL-10也明顯降低，從而導(dǎo)致Th17/T-reg失衡，比值明顯升高，表明哮喘發(fā)生的過程可能與Th17/T-reg失衡導(dǎo)致的免疫紊亂有關(guān)。T-reg細(xì)胞數(shù)量減少、導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的功能降低，而Th17細(xì)胞過度表達(dá)，通過分泌IL-17誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子的釋放而介導(dǎo)氣道炎癥，Th17/T-reg失衡這一新的機(jī)制有助于尋找新的治療哮喘的方法。

綜上所述，哮喘小鼠Th17細(xì)胞通過對(duì)哮喘氣道炎癥產(chǎn)生影響，促進(jìn)氣道內(nèi)中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞的聚集，從而在哮喘發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用，而Th17/T-reg的比例失衡彌補(bǔ)了Th1/Th2介導(dǎo)的效應(yīng)機(jī)制的不足，提示Th17/Treg失衡可能在哮喘的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。

[1]冉雪梅,趙燕,黃毅,等.阿奇霉素通過抑制Th17細(xì)胞功能活性改善小鼠哮喘炎癥[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,35(5):421-425.

[2]周麗蓉,張劼,羅永艾.肺炎鏈球菌3型多糖對(duì)支氣管哮喘小鼠氣道炎癥及Treg/Th17細(xì)胞的影響[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,34 (5):471-476.

[3]趙燕,冉雪梅,黃毅,等.構(gòu)建以Th17應(yīng)答為主致氣道中性粒細(xì)胞增高的小鼠哮喘模型[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,35(13):1376-1378.

[4]李鴻佳,張才擎,于翠香,等.Th17淋巴細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子加重哮喘小鼠氣道炎癥[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2012,28(11):1126-1128.

[5]周辰,陳軍浩,殷凱生.輔助性T細(xì)胞17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在哮喘小鼠中的失衡表達(dá)及其意義[J].中國(guó)呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志,2010, 9(1):28-31.

[6]藍(lán)丹,檀衛(wèi)平,夏焱,等.T-bet基因轉(zhuǎn)染對(duì)哮喘小鼠脾臟Th1/Th2平衡的影響[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2010,31(1):74-78.

[7]李燕,謝敏,史小玲,等.HSP70/CD80 DNA疫苗通過調(diào)節(jié)Th1/Th2/Treg/Th17細(xì)胞對(duì)小鼠急性哮喘的抑制作用[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2014,52(10):20-24.

[8]姜暉,陳霞霞,王金艷,等.川芎嗪對(duì)小鼠哮喘模型Th17細(xì)胞的調(diào)控作用以及對(duì)Th17、Treg細(xì)胞平衡的影響[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2014, 30(10):1339-1343.

[9]BAJORIUNIENE I,MALAKAUSKAS K,LAVINSKIENE S,et al. ResponseofperipheralbloodTh17cellstoinhaleddermatophagoides pteronyssinus in patients with allergic rhinitis and asthma[J].Lung,2012,190(5):487-495.

[10]凌昊,趙霞.Th17及相關(guān)細(xì)胞因子在哮喘中的作用研究[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2014,30(5):930-933.

[11]文丹丹,王敏.Th17細(xì)胞與支氣管哮喘關(guān)系的研究進(jìn)展[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2012,12(8):1042-1044.

（張立芳 編輯）

Roles of Th17 lymphocyte and its inflammatory cytokines in asthmatic mice

Shi-min SHAN,Yi-min MAO,Yu-xia SUN
(Department of Respiratory Medicine,First Affiliated Hospital,Henan University of Science and Technology,Luoyang,Henan 471000,P.R.China)

【Objectives】To investigate the roles of Th17 cell and its inflammatory cytokines in the exacerbation of airway inflammation of murine asthmatic model,and to discuss the influence of imbalance expression of Th17/T-reg in asthmatic mice.【Methods】Thirty mice were randomized into two groups:control group and asthma group. The mice of asthma group were sensitized and challenged with ovalbumin(OVA).The mice of control group were given normal saline alone under the same conditions as the asthma group.We observed the changes of Th17 and T-reg cells in cellular proportion in the bronchoalveolar lavage fluid(BALF)under a light microscope.And we detected the changes of Th17 and T-reg in cellular proportion in peripheral blood by flow cytometry method.The levels of IL-17 and IL-10 were detected by ELISA kits.A correlation analysis was done between Th17,T-reg and neutrophile granulocyte cells in the peripheral blood and neutrophils in BALF.【Results】The total cell number and the percentage of neutrophils,eosinophils and lymphocytes in BALF of the asthma mice were significantly higher than those of the control mice(P<0.05).The level of IL-17 in asthma group was significantly higher than that in the control group(P<0.05),and the level of IL-10 in asthma group was significantly lower than that in the control group(P<0.05).The expression of Th17 was positively correlated with the levels of neutrophils in BALF,and the expression of T-reg was negatively correlated with the levels of neutrophils in BALF.【Conclusion】Th17 cells could induce the asthma airway inflammation.And the imbalance expression of Th17/T-reg could play an important role in asthma pathogenesis.

asthma;Th17;IL-17;T-reg

R562.2；R-332

A

1005-8982（2015）25-0021-04

2014-12-17