白楊素抑制H1299細胞系肺癌干細胞樣細胞腫瘤球形成

冷超，韋兵，莫靚，龍超眾，馮耀光，賀大璞，王元星

（南華大學附屬第一醫(yī)院心胸外科，湖南 衡陽 421001）

·論著·

白楊素抑制H1299細胞系肺癌干細胞樣細胞腫瘤球形成

冷超，韋兵，莫靚，龍超眾，馮耀光，賀大璞，王元星

（南華大學附屬第一醫(yī)院心胸外科，湖南 衡陽 421001）

目的觀察白楊素是否抑制人肺癌H1299細胞系干細胞樣細胞腫瘤球形成能力，并探討其作用機制是否涉及CK2α表達和Notch1信號。方法干細胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)與擴增H1299細胞系球形成細胞作為肺癌干細胞樣細胞。不同濃度白楊素處理，腫瘤球形成法檢測H1299球形成細胞的腫瘤球形成率；Western blot分析CK2α、Notch1和CD44蛋白表達。CK2α siRNA轉染探討白楊素作用機制。結果白楊素（5、10和20μM）處理H1299球形成細胞72 h，腫瘤球形成率以濃度依賴方式降低；CK2α、Notch1和CD44蛋白表達下調。CK2α siRNA轉染H1299球形成細胞導致Notch1信號抑制，并協(xié)同白楊素抑制腫瘤球形成。結論白楊素具有抑制肺癌干細胞樣細胞腫瘤球形成作用，其作用機制涉及下調CK2α表達抑制Notch1信號傳導。

肺癌；肺癌干細胞；白楊素；CK2α；Notch1

腫瘤干細胞理論認為肺癌是一種干細胞疾病，干細胞自我更新性質使其自我復制性生存并不斷增殖和分化，干細胞自我更新的調控機制紊亂導致腫瘤發(fā)生和演進[1]。有研究顯示，Notch信號參與肺發(fā)育，并有促癌作用[2]。此外，腫瘤干細胞標志物CD44被證明是Notch信號下游靶基因，受Notch信號調控[3]，同時，Notch信號傳導和CD44調節(jié)干細胞自我更新能力[3]。CK2α（蛋白激酶CK2催化亞基）在包括肺癌在內的許多腫瘤中過表達[4]。ZHANG等[4]最近研究證明，CK2α抑制下調Notch1信號，并隨后降低人肺癌干細胞樣細胞群比例。

白楊素是一種在多種植物中廣泛存在的黃酮類化合物，具有抑制CK2和抗腫瘤作用[5-6]。新近的研究提供證據(jù)表明，白楊素類似物即8-溴-7-甲氧基白楊素具有逆轉宮頸癌干細胞樣細胞上皮-間充質轉化和抑制肝癌干細胞自我更新作用[7]。本文檢測白楊素是否抑制人肺癌H1299細胞系干細胞樣細胞腫瘤球形成，并探討其作用機制是否涉及CK2α、Notch1和CD44蛋白表達下調。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)

人非小細胞肺癌H1299細胞系細胞購自中國科學院細胞庫（中國上海市），細胞用添加10%熱滅活胎牛血清，青霉素（100μg/mL）和鏈霉素（100μg/mL）的DMEM/F12培養(yǎng)基，在含5%二氧化碳CO2的37℃增濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和擴增。

1.2細胞成球培養(yǎng)

為了獲得H1299細胞系球形成細胞，用添加20 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）（PeproTech公司）、20 ng/mL表皮生長因子（epidermal growth factor,EGF）（PeproTech公司）、5μg/mL胰島素（Sigma-Aldrich公司）、0.4%牛血清清蛋白（BSA，Invitrogen公司）和0.02×B27添加物（Invitrogen公司）的無血清DMEM/F 12培養(yǎng)基接種于超低黏附6孔板懸浮培養(yǎng)細胞，細胞密度為105個/mL。每3天補充培養(yǎng)液1.0 mL。培養(yǎng)9 d，收集球形成細胞，分散成單細胞懸液并再懸浮于新鮮干細胞條件培養(yǎng)基中進行傳代培養(yǎng)。

1.3腫瘤球形成率測定

為了測定白楊素（美國Sigma公司）對腫瘤球形成率的影響，細胞以1 000個/mL的密度接種于超低黏附24孔培養(yǎng)板，每孔1 mL。培養(yǎng)9 d，計數(shù)腫瘤

球數(shù)。腫瘤球形成率（%）=每孔腫瘤球均數(shù)/每孔接

種活細胞數(shù)（1000）×100%。

1.4siRNA轉染

CK2α siRNA與對照siRNA為美國Thermo Scientific公司（Waltham，MA）產品。按照廠商的說明，使用陽離子脂質體RNAiMAX（Invitrogen，Carlsbad，CA）用50 nmol/L siRNA轉染細胞。Western blot分析確證siRNA敲除效率。

1.5Western blot分析

參照文獻[7]的方法，用裂解緩沖液（50 mM Tris-HCl（pH 7.4）、150 mM NaCl、0.2 mM EDTA、0.2%NP-40、10%甘油、1 M β-Me、1μg/mL抑肽酶、0.1 mM Na3VO4、0.5 mM 4NPP、0.5 mM NaF和蛋白酶抑制劑）裂解細胞。Bradford法測定蛋白含量。10%SDS-聚丙烯凝膠電泳分離蛋白并轉移至聚偏氟乙烯膜（PVDF）。用含5%脫脂牛奶PBST封閉PVDF膜，抗-CK2α（Millipore公司）、抗-活化型Notch1和抗-CD44（Cell Signaling，Beverly，MA）以及抗-β-actin（Sigma公司）抗體作為一抗，在4℃、輕微震動條件下孵育PVDF膜過夜。然后，用過氧化物酶連接二抗孵育膜1 h，根據(jù)廠商說明書的操作步驟，用增強化學發(fā)光儀（Amersham Biosciences）檢測信號。

1.6統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示。應用SPSS 13.0 Windows軟件系統(tǒng)（SPSS Inc，Chicago，IL）分析所有數(shù)據(jù)。Student’st-檢驗用于比較各組間的差異。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1肺癌H1299細胞系球形成細胞具有自我更新特性

干細胞條件培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)法結果顯示：H1299細胞系能形成非粘附性腫瘤球（圖1A），稱為球形成細胞。球形成細胞傳代培養(yǎng)結果證明：分散的單個細胞能形成新腫瘤球，以第3代球細胞的腫瘤球形成率最高（圖1B）。提示：H1299細胞系球形成細胞具有自我更新能力。因此，在后續(xù)試驗研究中，我們以H1299細胞系第3代球形成細胞作為肺癌干細胞樣細胞模型。

2.2白楊素有效減弱H1299細胞系球形成細胞自我更新能力

腫瘤球形成率檢測結果證實：ChR（5、10和20μM）處理H1299細胞系第3代球形成細胞72 h，腫瘤球形成率以濃度依賴降低（圖2）。說明：ChR有效減弱H1299細胞系球形成細胞自我更新能力。

圖1 人肺腺癌H1299細胞系成球培養(yǎng)

圖2 白楊素對H1299細胞系球形成細胞自我更新的影響

2.3白楊素抑制H1299細胞系球形成細胞CK2α、Notch1和CD44蛋白表達

Western blot分析結果表明：ChR濃度依賴性下調H1299球形成細胞CK2α、Notch1和CD44蛋白表達（圖3）。

圖3 白楊素對H1299球形成細胞CK2α、Notch1和CD44蛋白表達的影響

2.4CK2α沉默下調Notch1及其靶基因蛋白表達

Western blot分析結果發(fā)現(xiàn)：CK2α特異性siRNA轉染H1299細胞系球形成細胞導致CK2α蛋白水平明顯下調（圖4，上泳道）；Notch1和CD44蛋白水平下降（圖4，中泳道和下泳道）。

圖4 CK2α siRNA轉染對H1299細胞系球形成細胞CK2α、Notch1和CD44表達的影響

圖5 CK2α siRNA轉染聯(lián)合白楊素處理對H1299細胞系球形成細胞CK2α、Notch1和Gli1表達的影響

2.5CK2α抑制增強白楊素抑制Notch1及其靶基因蛋白表達作用

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)：與對照siRNA轉染細胞相比。CK2α siRNA轉染與10μM ChR合用導致H1299細胞系球形成細胞CK2α、Notch1和CD44蛋白表達水平進一步下降（圖5）。

2.6CK2α抑制協(xié)同白楊素降低腫瘤球形成率

腫瘤球形成法檢測結果表明：CK2α siRNA轉染導致H1299球形成細胞的腫瘤球形成率下降（圖6），并顯著增強ChR（10 μM）降低H1299球形成細胞腫瘤球形成率作用（圖6）。

圖6 CK2α siRNA轉染聯(lián)合白楊素處理對H1299球形成細胞自我更新的影響

3 討論

本文的實驗結果顯示：在人肺癌H1299細胞系球形成細胞，多功能蛋白激酶CK2為Notch1信號正性調節(jié)因子。其證據(jù)包括：首先，CK2α siRNA轉染抑制CK2α導致Notch1蛋白水平下降。其次，CK2α敲除引起Notch1信號靶基因（CD44）產物表達下調。第三，CK2α敲除導致人肺癌H1299細胞系球形成細胞的腫瘤球形成率降低。

已有研究報道稱Notch1能被CK2在絲氨酸1901處磷酸化并且這種磷酸化負性調節(jié)Notch1轉錄活性[8]。CK2磷酸化Notch1第2個絲氨酸位點（S847）有可能增強Notch1蛋白穩(wěn)定性[8]。ZHANG等[4]通過CK2α siRNA處理后的蛋白降解試驗證明，CK2α沉默縮短A549細胞Notch1蛋白半衰期；說明這種CK2對Notch1的正性調節(jié)作用部分歸因于減少蛋白降解。然而，CK2正性調節(jié)Notch1信號精確分子機制尚待深入研究。

已有研究報道，在非小細胞肺癌H1299細胞系，球形成細胞富集表達CD44干細胞樣細胞[9]。本文的研究結果亦證實，H1299球形成細胞具有自我更新特性，并高表達干細胞標志物CD44蛋白。特別值得注意的是，來源豐富的黃酮類化合物白楊素顯著抑制H1299細胞系球形成細胞自我更新能力，并與CK2α siRNA轉染協(xié)同性下調CK2α、Notch1和CD44蛋白表達。這些結果為應用小分子CK2α抑制劑調控Notch信號靶向抑制肺癌干細胞樣細胞特性治療人非小細胞肺癌提供了合理性解釋。

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（王榮兵 編輯）

Inhibitory effects of chrysin on tumor sphere formation of lung cancer stem-like cells from H1299 cell line

Chao LENG,Bing WEI,Liang MO,Chao-zhong LONG,Yao-guang FENG, Da-pu HE,Yuan-xing WANG
(Department of Thoracic Cardiovascular Surgery,the First Affiliated Hospital of University of South China,Hengyang,Hunan 421001,P.R.China)

【Objective】To investigate whether Chrysin(ChR)inhibits the capacity of tumor sphere formation in lung cancer stem cell-like cells(LCSCLCs)derived from H1299 cell line and whether the mechanism underlying this action is associated with inhibition of CK2α expression and Notch1 signaling.【Methods】Sphere-forming cells (SFCs)from H1299 cell line which were suspended cultured with stem cell-conditioned medium were taken as LCSCLCs.H1299 SFCs were treated with various concentrations of ChR.Self-renewal capacity was detected by tumor sphere-forming assay.The expression of CK2α,Notch1 and CD44 was detected by Western blot analysis.The mechanism by which chrysin inhibits self-renew of H1299 SFCs was explored using CK2α siRNA transfection.【Results】After treatment with ChR(5,10 and 20 μM)for 72 h,the rate of tumor sphere-forming of H1299 SFCs was decreased in a concentration-dependent manner.CK2α siRNA transfection led to inhibition of Notch1 signal pathway in H1299 SFCs.CK2α siRNA transfection also can enhance the inhibitory effect of ChR on the capacity of tumor sphere-forming in LCSCLCs.【Conclusion】The inhibitory effect of ChR on tumor sphere-forming capacity of LCSLCs derived from H1299 cell line is associated with down-regulation of CK2α expression and inhibition of Notch1 signal pathway.

lung cancer;lung cancer stem cells;chrysin;CK2α;Notch1

R734.2

A

1005-8982（2015）25-0030-04

2015-03-16