膀胱癌中miR-128與血管內皮生長因子C的靶向調控關系

祖雄林，周旭，陳金波，崔雨，齊琳

（中南大學湘雅醫院1.國際醫療部；2.泌尿外科，湖南 長沙 410008）

·論著·

膀胱癌中miR-128與血管內皮生長因子C的靶向調控關系

祖雄林1，周旭2，陳金波2，崔雨2，齊琳2

（中南大學湘雅醫院1.國際醫療部；2.泌尿外科，湖南 長沙 410008）

目的研究人膀胱尿路上皮癌細胞和組織中的miR-128與血管內皮生長因子C（VEGF-C）的靶向調控關系及其生物學功能。方法收集9對配對的膀胱癌組織和其癌旁組織，1株人正常尿路上皮細胞（SV-HUC-1）和4株膀胱癌細胞（T24、5637、UM-UC-3和RT4），通過RT-PCR、Western Blot方法檢測VEGF-C和miR-128的表達水平；將miR-128復合物或miR-128抑制劑等復合物轉染到2株膀胱癌T24和5637細胞中，檢測miR-128對其生長、遷移及侵襲的影響；生物信息學軟件預測分析miR-128的靶基因，雙熒光素酶實驗驗證miR-128是否靶向作用VEGF-C。結果相比癌旁組織和正常尿路上皮細胞，膀胱癌組織和細胞中miR-128的表達明顯下調（P＜0.05），而VEGF-C在癌組織和細胞中都呈現高表達（P＜0.05）。miR-128可抑制膀胱癌細胞生長、克隆形成及遷移侵襲（P＜0.05）。雙螢光素酶報告實驗證實miR-128靶向作用VEGF-C（P＜0.05）。結論miR-128在膀胱癌中表達下調，而VEGF-C表達上調；miR-128可通過靶向調控VEGF-C影響膀胱癌細胞的增殖和轉移。

miR-128；血管內皮生長因子C；膀胱癌；靶向調控

膀胱癌（bladder cancer，BC）是泌尿生殖系發病率第二的腫瘤[1]。大約有50%的患者被診斷為肌層浸潤性膀胱癌，伴有肺部和肝臟等遠處轉移，導致5年生存率較低[2]。目前，進一步提高生存率的治療方法比較有限，腫瘤轉移的潛在機制目前沒有明確。

小分子核糖核酸（microRNA）是內源性的微小RNA分子，通過調節基因的表達，在腫瘤發生中扮演重要的角色。微小RNA128（microRNA128，miR-128）是一種雙面miRNA，目前在神經膠質瘤中研究最多。它可以通過靶向作用于Bmi-1（B-cell specific moloney leukemiavirus insertion site 1，Bmi-1）、E2F3a（E2F transcription factor 3 a，E2F3a）和促有絲分裂的激酶抑制神經膠質瘤細胞增殖和生長[3]。此外，miR-128可靶向作用于p70S6K1（p70 ribosomal protein S6 kinase 1，p70S6K1）抑制腫瘤生長和血管生成[4]，在大多數情況下，miR-128是抑癌基因，例如miR-128可降低神經母細胞瘤、前列腺癌細胞的能動性和侵襲性[5-6]。但目前還罕有關于miR-128在膀胱癌中的作用的報道。

血管內皮生長因子C（vascular endothelial growth factor c，VEGF-C）與血管生成、淋巴管生成和區域淋巴結轉移有關，被報道有抗凋亡和增殖的作用[7]。RNA干擾VEGF-C能抑制惡性進展和提高絲裂霉素C對膀胱癌T24細胞的敏感性[8]，但膀胱癌中miR-128和VEGF-C之間的關系仍然未知。因此，本研究擬確定膀胱癌組織和細胞中miR-128和VEGF-C的表達水平，研究miR-128在5637、T24細胞增殖、遷移和侵襲中的作用。驗證在T24和5637細胞株中，miR-128與VEGF-C的靶向作用關系，為膀胱癌的診斷或治療尋找新的分子靶標。

1 材料和方法

1.1材料

選取中南大學湘雅醫院泌尿外科2013年10月-2014年4月的9例膀胱癌患者癌組織和癌旁組織標本，均來自于膀胱腫瘤患者的手術切除組織。取術中切除的膀胱腫瘤組織，同時隨機采取于距離腫瘤邊緣2 cm以外的癌旁組織。所有標本均由病理科醫生根據組織切片作出病理診斷為膀胱癌。所有患者術前未行放療和化療。膀胱癌細胞株T24、5637、UM-UC-3、RT4及正常尿路上皮細胞系SV-HUC-1等細胞株均購自于中南大學湘雅醫學院細胞中心及代購自美國ATCC公司。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應按照說明書步驟用Trizol試劑從細胞試劑盒中提取收集細胞、膀胱癌組織及癌旁組織中的總RNA，選取A260/A280比值在1.8～2.0之間的RNA標本進行逆轉錄。用實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，Real time PCR）檢測miR-128和VEGF-C的相對表達量。特殊引物miR-128（HmiRQP3056）和U6（HmiRQP9001）、miR-128復合物（miR-128 mimics）或抑制劑（inhibitor）及陰性對照組（negative control，nc）由廣州復能公司合成。配對引物序列具體如下：VEGF-C轉錄引物：5'-CACGAGCTACCTCAGCAAG A-3'，逆轉錄引物：5'-GCTGCCTGACACTGTGGTA-3'；β-actin作為內參，轉錄引物：5'-AGGGGCCGGA CTCGTCATACT-3'和逆轉錄物：5'-GGCGGCACCA CCATGTACCCT-3'。使用GraphPad Prism 4.0軟件和2-ΔΔCt求基因相當表達量方法，分析VEGF-C mRNA和mir-128的表達水平。

1.2.2蛋白分離和免疫印跡試驗通過免疫印跡試驗（Western blot）對蛋白表達水平進行量化分析。采用凝膠電泳等方法處理蛋白樣本，然后用β-actin（1∶500）兔多克隆抗體，anti-VEGF-C（1∶500）兔多克隆抗體進行檢測。適量TBST溶液漂洗10 min× 3次后，暗室內浸入ECL液顯色，并使膠片曝光，定影，洗片。由凝膠圖像掃描系統對擴增產物的電泳條帶膠片進行密度掃描，用圖像分析軟件IPP 6.0對圖像進行曝光灰度分析。

1.2.3細胞轉染按照說明書使用脂質體轉染試劑，在轉染12 h前先將細胞鋪到六孔板中。高效穩定轉染陰性對照、miR-128 mimics或miR-128 inhibitor入膀胱癌T24和5637細胞中，在培養箱中孵育48 h，以利下一步實驗進行miR-128的功能分析。

1.2.4細胞增殖試驗細胞生長增殖能力是通過四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法來檢測的。取轉染后的膀胱癌T24或5637細胞，細胞分組（NC、inhibitor或mimics組）進行消化，調制成細胞懸液，鋪96孔細胞培養板，每孔2×103個細胞。在每個反應孔加入20μl濃度為5 mg/ml的MTT溶液，培養4 h，再去上清液，每孔加入150μl DMSO溶液沉淀，培養10 min，用酶標儀檢測各孔的吸光值，測定波長為570 nm。

1.2.5 平板克隆形成試驗膀胱癌T24、5637細胞分組（NC、inhibitor或mimics組）進行消化，調制成細胞懸液，按照50個細胞/ml細胞懸液接種到每個六孔培養板中。置于細胞培養箱中培養14 d后漂洗染色，培養條件為37℃，5%二氧化碳CO2。克隆計數，計算克隆形成率，比較克隆形成能力。

1.2.6細胞侵襲實驗膀胱癌細胞體外侵襲能力的評估在24孔板Transwell小室中進行。細胞分組及準備如前所述，加入200μl細胞懸液（1×106細胞/ml）至小室內。培養染色后，沖洗干燥Transwell小室，用酶標儀測定各孔的OD值，測定波長為570 nm。

1.2.7細胞遷移實驗使用劃痕修復實驗評估細胞的遷移能力。細胞培養并轉染后，檢測其劃痕修復情況。劃痕寬度約1 mm，在無血清培養基中進行細胞清洗和培養。以劃痕時間為起點，在0、24和48 h分別在顯微鏡下觀察各組細胞劃痕修復情況。

1.2.8雙熒光素酶報告分析軟件預測顯示VEGF-C基因的3-UTR包含mir-128的結合位點，通過DNA聚合酶以基因組DNA為模板進行PCR克隆擴增。再在NotⅠ和XhoⅠ這2個酶切位點間插入到psiCHECKTM-2質粒中，其相應的突變序列克隆到psi-CHECKtm-2，分別名叫VEGF-C-3'-UTR和Mut-VEGF-C-3'-UTR。使用脂質體2000（表達載體），T24、5637細胞共轉染報告質粒和miR-128模擬物，miR-128抑制劑，陰性對照組或陰性對照抑制劑等。熒光素酶活性被確定于48 h后，使用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System進行樣品熒光素酶的活性檢測。

1.3統計學方法

2 結果

2.1miR-128和VEGF-C的表達

miR-128在膀胱癌組織和癌細胞中低表達，而VEGF-C則是高表達。相比鄰近正常組織，膀胱癌組織中miR-128的mRNA水平明顯低于正常組織，而VEGF-C的mRNA水平是相反的（P＜0.05，圖1A和2A）。與此同時，與正常膀胱移行上皮細胞株SV-HUC-1相比，膀胱癌細胞中可見mir-128表達下調和VEGF-C表達上調（P＜0.05，圖1B和2B）。免疫印跡分析，與癌旁組織和SV-HUC-1相比，膀胱癌組織和癌細胞株的VEGF-C蛋白表達明顯增加（P＜0.05，圖2C和2D）。這些結果表明，在膀胱癌的惡性進展中，miR-128可能發揮了重要作用。此外，VEGF-C上調和miR-128下調的共存提示膀胱癌細胞中潛在的調控相關性。

圖1 miR-128 mRNA的表達水平比較

2.2miR-128的過表達可以減少膀胱癌T24和5637細胞中VEGF-C的表達

通過體外轉染miR-128 mimic的方式來進行細胞功能實驗，了解miR-128在膀胱癌T24、5637細胞中的功能。轉染pre-mir-128后，mir-128的mRNA水平顯著上調而VEGF-C的mRNA水平下調（P＜0.05）。與之相反，當轉染anti-mir-128，mir-128的mRNA水平下調和VEGF-C的mRNA水平上調（P＜0.05）。這表明mir-128的過表達可以減少膀胱癌T24和5637細胞中VEGF-C的表達。見圖3。

圖2 VEGF-C mRNA和蛋白的表達水平比較

圖3 mir-128和VEGF-C在膀胱癌T24和5637細胞功能模型中的表達

2.3 miR-128在膀胱癌T24和5637細胞中直接靶向作用VEGF-C

克隆擴增包含miR-128結合位點的VEGF-C-3-UTR片段和變異的目標序列，通過psi-CHECK2雙熒光素酶報告基因載體，共轉染miR-128復合物到膀胱癌T24和5637細胞。結果顯示，miR-128模擬物抑制轉染了野生型即VEGF-C-3-UTR的T24和5637細胞的熒光素酶活性。然而，miR-128模擬物沒有抑制轉染了突變型即Mut-VEGF-C-3-UTR的T24和5637細胞的熒光素酶活性，見圖4。這證實了VEGF-C是miR-128的直接靶基因。

2.4miR-128抑制膀胱癌細胞的生長和克隆形成能力

為了解miR-128對細胞的影響，通過miR-128模擬物或其抑制劑轉染膀胱癌T24和5637細胞，利用MTT比色實驗和平板克隆形成實驗檢測細胞生長和克隆形成能力，與陰性對照轉染細胞組相比，膀胱癌細胞中miR-128的過表達顯著降低了T24和5637細胞的生長率（圖5A和5B）和克隆形成能力（圖5C和5D）。然而，相比陰性對照組，miR-128轉染抑制劑組細胞的生長率和克隆形成顯著增加。它表明miR-128可以抑制膀胱癌T24和5637細胞的生長增殖。

2.5miR-128抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲能力

通過Transwell小室和劃痕修復實驗測定細胞的遷移和侵襲能力。結果顯示，當膀胱癌T24和5637細胞轉染miR-128過表達物后，細胞遷移和侵襲能力明顯更強，當膀胱癌T24和5637細胞轉染miR-128抑制劑后，細胞遷移和侵襲能力顯著降低，見圖6。結果表明，miR-128可以抑制膀胱癌T24和5637細胞的遷移和侵襲能力。

圖4 mir-128反向調控VEGF-C的表達

圖5 miR-128對膀胱癌細胞生長增殖的影響

圖6 miR-128對膀胱癌細胞遷移和侵襲能力的影響

3 討論

膀胱癌是泌尿生殖系統常見腫瘤，膀胱癌患者多以尿路上皮細胞癌的病理類型居多，具有易浸潤、易轉移、易復發等特點[9]。目前，在已有的治療方案下提高存活率的進展是有限的，這很大程度上是由于致腫瘤轉移的機制還不是很清楚。因此，探索關鍵因素介導的膀胱癌生長和轉移的分子機制對于開發有效的治療很重要。研究人員一直在尋找新的生物標志物，其中一個重要的研究方向是microRNAs（miRNAs）在膀胱癌的發生發展過程中的表達及作用。

MiRNAs是不翻譯成蛋白的小RNA分子，成熟的miRNA約18～22個核苷酸的長度。研究發現這些miRNA表達情況不僅在惡性腫瘤與正常組織之間存在差異表達，在不同類型的癌癥之間及相同癌癥的不同亞型都不同[10]。因此，miRNAs被認為具有成為癌癥早期診斷或預測生物標記的潛力，它們或許能作為不同腫瘤疾病的治療靶點[11]。在不同組織或細胞中，miR-128被發現是一種有雙面性的微小RNA。在大多數情況下，它作為抑癌基因，其功能包括調節細胞增殖、遷移、凋亡和耐藥性，但對其在膀胱癌的表達和功能研究是非常有限的[12]。

本研究檢測了9例膀胱癌組織及癌旁組織中miR-128的mRNA表達水平。結果表明，相比癌旁組織，miR-128在膀胱癌中的表達顯著降低。與此同時，與正常尿路上皮細胞相比，它在4株膀胱癌細胞中的表達均下調。這表明，在膀胱癌中，miR-128可能是一個抑癌基因。分別在膀胱癌T24和5637細胞中轉染pre-mir-128和anti-mir-128，構建了功能獲取和功能抑制的細胞模型，以進一步研究mir-128在膀胱癌中的生物學功能。使用MTT比色實驗、平板克隆形成試驗、劃痕修復實驗和Transwell小室實驗，本研究發現miR-128可以抑制膀胱癌T24和5637細胞的生長，增殖、遷移和侵襲能力。這些結果與之前在其他腫瘤中的研究是一致的[5，13]。

VEGF-C與血管生成、淋巴管生成和區域淋巴結轉移有關，被報道有抑制凋亡和增殖的作用[14]。由生物信息學軟件預測，VEGF-C是miR-128的目標基因之一，并且在部分腫瘤中得到了驗證。在人類非小細胞肺癌的腫瘤生成、血管生成和淋巴管生成中，miR-128可直接靶向作用于VEGF-C，并起著至關重要的作用[15]，但是miR-128、VEGF-C之間的關系在膀胱癌中仍然是未知的。本研究使用雙熒光素酶基因報告分析，驗證了膀胱癌T24和5637細胞中miR-128和VEGF-C之間的直接靶向關系。

綜上所述，本研究初步證明了膀胱癌組織和細胞中，miR-128是顯著下調的，而VEGF-C顯著上調；膀胱癌細胞中miR-128直接靶向作用于VEGF-C，從而影響膀胱癌的進展。這說明miR-128可作為膀胱癌診療的一個新方向。雖然本研究提示了膀胱癌中miR-128靶向調控VEGF-C這一信號通路可能的分子機制，但是還需要進一步的研究來闡明其具體機制。下一步將采取加大樣本量、構建VEGF-C穩定沉默的細胞模型和進行體內動物實驗的方法來深入探討miR-128在膀胱癌中的生物學功能、作用機制及臨床意義。

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（王榮兵 編輯）

Mir-128 is down-regulated in bladder cancer and inhibits tumor cell proliferation by targeting VEGF-C

Xiong-lin ZU1,Xu ZHOU2,Jin-bo CHEN2,Yu CUI2,Lin QI2
(1.International Medical Center;2.Department of Urology,Xiangya Hospital,Central South University,Changsha,Hunan 410008,P.R.China)

【Objective】To investigate the regulation of miR-128 on VEGF-C expression and its biological effect in bladder cancer.【Methods】Materials including 9 pairs of bladder cancer tissues and adjacent tissues,4 bladder caner cell lines(T24,5637,UM-UC-3,RT4)and 1 normal urothelial cell(SV-HUC-1)were collected.The miR-128 and VEGF-C mRNA and protein expression were tested by RT-PCR and Western blot,respectively.The miR-128 minics and miR-128 inhibitor were transfected into bladder cancer cells T24 and 5637 through lipidosome.And the effect of miR-128 on bladder urothelial cancer cells proliferation,invasion and metastasis were tested.Target gene of miR-128 analysis was applied by related biological information software.Dual luciferase reporter gene assay verified targeted relationship between miR-128 and VEGF-C.【Results】We found miR-128 was down-regulated in bladder cancer tissues and cell lines which was opposite from the expression of VEGF-C(P<0.05).Overexpression of miR-128 could inhibit proliferation,migration and invasion of bladder cancer cells(P<0.05).Dual luciferase reporter gene assay showed VEGF-C was a direct target of miR-128 in bladder cancer cells(P<0.05).【Conclusions】miR-128 was down-regulated in bladder cancer,meanwhile VEGF-C was up-regulated.MiR-128 downregulation can promote the growth and metastasis of bladder cancer cells by involving VEGF-C up-regulation.

miR-128;VEGF-C;bladder cancer;target regulating

R737.14

A

1005-8982（2015）25-0038-07

2015-06-10

周旭，E-mail：zx315zx@163.com