KAI1/CD82和β-環連蛋白在腎透明細胞癌中的表達及其相互關系*

王連渠，卜宏民，閆擁軍，車新平，徐國良，焦志靈，張二軍

（河南大學第一附屬醫院泌尿外科，河南 開封 475001）

·論著·

KAI1/CD82和β-環連蛋白在腎透明細胞癌中的表達及其相互關系*

王連渠，卜宏民，閆擁軍，車新平，徐國良，焦志靈，張二軍

（河南大學第一附屬醫院泌尿外科，河南 開封 475001）

目的探討KAI1/CD82和β-環連蛋白（β-catenin）蛋白在腎透明細胞癌（RCCC）組織中的表達及其相互關系。方法應用免疫組織化學SP法對91例腎透明細胞癌和30例正常腎組織進行KAI1/CD82和β-catenin蛋白檢測。結果RCCC組織中，KAI1/CD82和β-catenin蛋白異常表達率分別為46.2%（42/91）和54.9%（50/91），且兩者之間的表達具有顯著相關性（P＜0.05）。β-catenin蛋白的異常表達與RCCC的病理學分級、肌層浸潤和淋巴結轉移有相關性（P＜0.05）。KAI1/CD82的表達在侵襲轉移組和非侵襲轉移組之間差異有統計學意義（P＜0.05），和病理分級無關（P＞0.05）。結論KAI1/CD82蛋白異常表達與腎透明細胞癌是否轉移有關，而β-catenin異常表達與腎透明細胞癌是分化、惡性程度有關，故對其檢測有助于對腎透明細胞癌診斷和治療進行全面的評估。

KAI1/CD82；β-環連蛋白；腎透明細胞癌；免疫組織化學

腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）簡稱為腎癌，是惡性程度較高的腫瘤，起源于腎實質泌尿小管上皮系統。調查結果表明，腎癌僅次于膀胱腫瘤，在泌尿生殖系統腫瘤中占第二位，其中，透明細胞癌（renal clear cell carcinoma，RCCC）較常見，占全部腎癌的70%左右[1]。臨床上患者往往預后不良主要與腫瘤的侵襲性生長及轉移有密切關聯。因此，深入探討腎癌浸潤和轉移相關的分子機制，可以為臨床工作提供寶貴的借鑒價值。近年來研究表明，腫瘤細胞表面黏附性改變與腫瘤細胞浸潤轉移密切相關，而β-環連蛋白（β-catenin）是細胞內的一種蛋白質，其在細胞內的表達量與腫瘤的發生、發展、轉移關系密切[2]。另外，KAI1基因是近年發現的一種腫瘤抑制基因，對多種腫瘤的惡性進程有抑制作用。KAI1基因的蛋白表達產物為CD82，是四穿膜超家族（transmembrance-4 super-family，TM4SH）成員[3]。本研究采用免疫組織化學SP法檢測KAI1和β-catenin在RCCC中的表達，初步探討其在RCCC臨床分期及惡性程度判斷中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1收集標本

臨床資料來源于我院泌尿外科2012年10月-2014年2月腎透明細胞癌石蠟樣標本91例。年齡40～68歲，中位年齡47歲；依照中國泌尿外科疾病診斷治療指南（2009年），腫瘤分級[按照WHO推薦Fuhrman分級標準（1997年）]：Fuhrman I～II級（高分化）49例，Fuhrman III級（中分化）20例，Fuhrman IV級（低分化或未分化）22例；無淋巴轉移者68例，出現淋巴轉移者23例。對照組為30例同期因腎外傷作腎切除的正常腎組織。其中，男16例，女14例；年齡7～66歲，中位年齡38歲。所有標本均經術后病理學檢查確診，且有完整的臨床和病理資料。

1.2檢測方法

手術切除標本，經過常規固定、脫水、透明、浸蠟、包埋之后石蠟切片機制成6～8μm的切片，并將切片放入60～65℃水中展平，然后將其轉移到涂過多聚賴氨酸的載玻片。將石蠟切片進行PAS染色和免疫組織化學SP染色。所用的一抗：濃縮型鼠抗人KAI1/CD82單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）和β-catenin鼠抗人單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）。免疫組織化學SP試劑盒和DAB顯色試劑均購自福建邁新生物技術有限公司。

1.3結果判定

由2位病理學醫師在不知臨床病理資料的情況下對免疫組織化學的結果進行評估，在顯微鏡下，每張切片隨機選擇5個視野，40×10高倍顯微鏡下觀察計數100個瘤細胞。KAI1/CD82陽性細胞表現為細胞膜棕黃色；β-catenin陽性信號位于細胞膜和細胞質，呈棕黃色顆粒。評分標準[4]采用3個參數的半定量積分方法：即染色強度（A）、陽性細胞數（B）和兩者計分的乘積。完全不染色、淺棕黃色、棕黃色及深棕黃色分別賦值為0、1、2及3分；陽性細胞百分比0%～24%、25%～49%、50%～74%和75%～100%分別賦值為1、2、3及4分，兩者相乘為陽性得分。兩者計分乘積，0分為陰性（-）、1～4分為弱陽性（+）、5～8分為中度陽性（++）、9～12分為強陽性（+++）。（++～+++）計為陽性率或異常表達率；（-～+）計為陰性率及正常表達率。

1.4統計學方法

應用SPSS 17.0軟件包進行統計分析。采用χ2檢驗及Spearman等級相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1正常腎臟和腎透明細胞癌HE染色形態

正常腎臟（圖1A）光鏡下可見：腎小球由血管球和腎小囊組成。腎透明細胞癌（圖1B）光鏡下可見：腫瘤細胞圓形或多邊形，排列呈實性，有寬廣的透明細胞質，含豐富糖原和類脂。間質不多，含豐富的毛細血管和血竇。

2.2KAI1/CD82在正常腎組織和腎透明細胞癌組織的表達

KAI1/CD82主要在細胞漿和（或）細胞膜表達，見圖2。RCCC組織中，KAI1/CD82陽性表達率為46.2%（42/91）；在30例正常腎組織中的陽性表達率為73.3%（22/30），對實驗數據進行量化分析表明：兩者差異有統計學意義。見表1，χ2=6.69，P＜0.05。

2.3β-catenin在正常腎組織和腎透明細胞癌組織的表達

β-catenin正常腎小管上皮胞質低表達或不表達（圖3A），在30例正常腎組織中的陽性表達率為6.7%（2/30）；在RCCC中胞質高表達或蓄積（圖3B），β-catenin陽性表達率為54.9%（50/91）；對實驗數據進行量化分析表明：兩者差異有統計學意義。見表2，χ2=21.46，P＜0.05。

2.4 KAI1/CD82和β-catenin表達與腎透明細胞癌臨床病理學參數的關系

研究結果顯示，RCCC組織中KAI1/CD82的異常表達在侵襲轉移組和非侵襲轉移組之間差異有統計學意義（P＜0.05），和病理分期無關（P＞0.05）；β-catenin蛋白的異常表達與RCCC的病理學分級、肌層浸潤和淋巴結轉移有關（P＜0.05）。見表3和4。

2.5KAI1/CD82和β-catenin在腎透明細胞癌組織中表達的相互關系

研究結果顯示，在91例腎透明細胞癌組織中KAI1/CD82和β-catenin均陰性表達的有11例，均陽性表達的有12例，KAI1/CD82陽性表達β-catenin陰性表達者30例，而KAI1/CD82陰性表達β-catenin陽性表達者38例。統計學分析顯示兩者呈負相關。見表5，r=-0.491，P＜0.05。

圖1 正常腎與腎透明細胞癌的結構比較（HE染色，×200）

圖2 正常腎組織和腎透明細胞癌KAI1/CD82的陽性表達（免疫組織化學，×200）

圖3 正常腎組織和腎透明細胞癌β-catenin的表達比較（免疫組織化學，×400）

表1 兩組KAI1/CD82蛋白陽性表達率的比較例（%）

表2 兩組β-catenin蛋白陽性表達率的比較例（%）

表3 KAI1/CD82表達與腎透明細胞癌臨床病理學參數的關系例（%）

表4 β-catenin表達與腎透明細胞癌臨床病理學參數的關系例（%）

表5 在子宮內膜癌組織中KAI1/CD82和β-catenin的表達相關性分析例

3 討論

惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的重大疾病，與腦血管疾病、糖尿病并列為人類的“三大殺手”[5]。腎透明細胞癌是常見的泌尿系惡性腫瘤，近年來發病率逐漸上升。在人類探索腫瘤的曲折道路中，頗受關注的、同腫瘤發生發展最為密切的是腫瘤轉移機制。臨床上絕大多數的惡性腫瘤患者，最終是因為腫瘤轉移導致死亡，而很少一部分是死于原發癌。腫瘤的惡性生物學行為是一個多基因參與的，通過不同基因不同時相的差異表達進行調控的復雜過程[6]。目前，根據眾多學者對惡性腫瘤的長期研究發現，其呈浸潤性生長和轉移是最難攻破的障礙，如何快速的找到一個有效指標，在腫瘤尚未轉移之前準確評價腫瘤侵襲力與轉移潛能，是腫瘤防治中一個重要的課題。

KAI 1基因（Kang Ai 1）是1955年DONG等從轉移到AT6.1細胞系中的人第11號染色體中分離到的能特異性抑制腫瘤轉移的基因。DNA序列分析證明KAI1與CD82基因是相同的。KAI1/CD82屬于TM4SF成員之一，這是一類結構和功能都非常相似的細胞膜糖蛋白，擁有4個跨膜區，跨膜區上有些高度保守的具有極性的氨基酸，TM4SF在細胞的聚集、黏附、遷移和增殖中均有調節作用，其影響部分與TM4SF調節細胞黏附有關[7]。KAI1/CD82屬于惡性基因的負性調節基因，與人類許多惡性腫瘤關系密切，如CD82在前列腺癌、肺癌及膀胱癌等中表達下調[8-10]；在食道鱗形細胞癌原發灶和淋巴轉移灶中表達差異有統計學意義[11]。這些研究結果都顯示，KAI1/CD82在惡性腫瘤的發生、發展、侵襲轉移中發揮了重要作用。本研究結果顯示，在有、無淋巴結轉移的腎透明細胞癌組織中KAI1/CD82的陽性表達差異有統計學意義。提示腎透明細胞癌在發生淋巴結轉移的過程中伴隨著KAI1/CD82表達的下降，KAI1/CD82的表達可作為淋巴結轉移的一個指標。

β-catenin是Wnt信號通路中重要的下游信號分子，在細胞中存在轉位，可以從細胞漿轉入細胞核，與核內的Tcf轉錄因子形成復合物，調節Wnt相關基因的表達，從而參與細胞增殖的調控促進轉錄[12]。當Wnt通路被抑制時，β-catenin被GSK3β和CKI等激酶磷酸化，導致其降解而不在核內聚集。Wnt可與LDL受體相關蛋白結合，抑制β-catenin降解，使其穩定表達并轉位至細胞核，與Tcf轉錄因子結合成復合物，從而調節細胞增殖，促進轉錄。較多的研究表明，β-catenin基因突變或功能異常可導致細胞彌散甚至浸潤[13]。并且是引起Wnt通路活化、β-catenin向細胞核內集聚，最終導致細胞增殖的常見原因。β-catenin作為Wnt通路的核心蛋白，其在核內聚積及其功能的激活與腫瘤發生發展密切相關[14]。研究者在結直腸癌細胞中對Wnt/β-catenin信號通路下游的靶基因（c-Myc、cyclin-D1、MMP7、survivin及生長因子等）進行了較為深入的研究，發現β-catenin/Tcf轉錄激活復合體的上調或者β-catenin核集聚等原因可引起靶基因的活化從而抑制細胞的正常分化，導致腫瘤的發生及侵襲轉移[15]。本研究發現：腎透明細胞癌組β-catenin的陽性表達顯著高于正常腎組織組，β-catenin在腎透明細胞癌中的表達和病理分期、肌層侵潤和淋巴結的轉移有關，隨著子腎透明細胞癌分期的增加β-catenin表達的陽性率逐漸上升，結果表示β-catenin在腎透明細胞癌的進展中發揮著作用，并且隨腎透明細胞癌侵襲轉移的增加β-catenin的作用也漸漸加強，伴隨著腎透明細胞癌在深肌層的侵潤和淋巴結轉移β-catenin的表達也逐漸升高，提示：β-catenin陽性表達的惡性腫瘤的侵襲力和轉移能力更加強大。

最近的研究顯示KAI1/CD82在轉錄水平的調節與β-catenin相關[16]，β-catenin可以和reptin染色質重塑，進而形成β-catenin-reptin復合體，代替轉錄激活輔助因子Tip60復合體，直接和錨定于KAI1/CD82啟動子上的NFκBp50亞基結合[17]。結果顯示：HDAC3復合體等轉錄抑制輔助因子和β-catenin-reptin復合體結合會抑制KAI1/CD82的轉錄。LIU等[18]也認為：KAI1/CD82在具有侵襲性腫瘤中的低表達與β-catenin有關。本研究結果顯示：腎透明細胞癌組織中KAI1/CD82表達與β-catenin表達呈負相關。因此，對KAI1/CD82和β-catenin檢測有助于對腎透明細胞癌診斷和治療進行全面的評估。

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（王榮兵 編輯）

Expression of KAI1/CD82 and β-catenin and its relationship with renal clear cell carcinoma*

Lian-qu WANG,Hong-min BU,Yong-jun YAN,Xin-ping CHE, Guo-liang XU,Zhi-ling JIAO,Er-jun ZHANG
(Department of Urology,the First Affiliated Hospital of Henan University, Kaifeng,Henan 475001,P.R.China)

【Objective】To detect the expression of KAI1/CD82 and β-catenin protein in renal clear cell carcinoma(RCCC),and investigate the relation between it and RCCC development.【Methods】Immunohistochemical SP method(streptavidin-perosidase)was used to detect KAI1/CD82,β-catenin protein for 91 cases of RCCC and 30 cases of normal renal tissue.【Results】In RCCC group,the abnormal expression rates of KAI1/CD82 and β-catenin protein were respectively 46.2%(42/91)and 54.9%(50/91),and the expression of them was correlated with each other(P＜0.05).The abnormal expression of β-catenin protein was associated with RCCC pathological grade, myometrial invasion and lymph node metastasis(P＜0.05).The difference in the expression of KAI1/CD82 between invasion-metastasis group and non-invasion-metastasis group was statistically significant(P＜0.05),but KAI1/CD82 expression was not related with pathological grading(P＞0.05).【Conclusion】The abnormal expression of KAI1/ CD82 was associated with metastasis of RCCC,whereas β-catenin expression was associated with differentiation and malignancy degree of RCCC,and therefore their detection was contributed to comprehensive assessment of RCCC diagnosis and treatment.

KAI1/CD82;β-catenin;renal clear cell carcinoma;immunohistochemistry

R737.11

A

1005-8982（2015）25-0045-05

2015-05-21

河南省科技發展計劃項目（No：112300410077）