龍茭2號不同發育階段莖部活性氧的檢測分析

康璐瑤，崔海峰，邢阿寶，李帥，葉子弘

（中國計量學院生命科學學院/浙江省生物計量與檢驗檢疫技術重點實驗室，杭州，310018）

茭白（Zizania latifoliaTurcz）又名茭瓜、茭筍、菰手、雕胡，屬于禾本科多年生水生宿根性草本植物，無性繁殖，原產于中國和東南亞[1]，是我國第二大水生蔬菜，具有重要的經濟價值。茭白孕茭與茭白黑粉菌侵染茭白植株密切相關，茭白黑粉菌侵染茭白成功后，茭白的開花受到抑制，就會刺激茭白莖部膨大，形成可食用的膨大莖[2]。茭白黑粉菌是一種寄生真菌，其侵染茭白使茭白莖部膨大形成可食用肉質莖的過程，實際上就是一個感病的過程。研究發現植物受到病原物侵染，會誘導活性氧暴發，而大量活性氧的積累會造成細胞組分的嚴重損傷[3]。因此，植物在長期的進化過程中形成了一系列的免疫防御反應，存在多種活性氧清除機制，其中酶促保護機制，如超氧化物歧化酶 （SOD）、過氧化物酶（POD）在活性氧的清除中具有重要作用[4，5]。

本試驗對茭白與黑粉菌互作中龍茭2號植株自身的活性氧激活及相關保護酶的變化進行分析，通過對茭白不同部位中2種保護酶的活性變化分析，探討了茭白孕茭過程中茭白黑粉菌侵染引發的應激防御反應，為闡明茭白與黑粉菌互作機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種為雙季茭白龍茭2號，選取3個不同時期（5、10、15 cm）的膨大莖部。試驗所需材料在桐鄉董家茭白基地采集。

1.2 試驗方法

采用NBT組織染色法染色觀察，選取不同發育階段生長良好的龍茭2號茭白，設定肉質莖長度依次為5、10、15 cm，用刀片分別切取其尖端、中部和基部并制成切片，盡量使切片厚薄均勻。將制作好的樣品放入盛有750 μmol/L NBT溶液的平皿中，使NBT溶液沒過樣品，室溫染色6 h后，超純水洗滌3次后于電子顯微鏡下觀察染色情況。

參照宋鳳鳴等[6]的方法測定SOD活性，參照秦國政等[7]的方法測定POD活性。

2 結果與分析

2.1 NBT組織定位染色結果

NBT染色后觀察茭白莖部O2-·的分布狀態，可以看出橫切面（圖1A）中維管束位置染色較深，其他部位染色較淺；縱切（圖1B）染色發現茭白莖部的O2-·主要分布在維管束周圍，局部成片分布。由此可見，莖部膨大過程中，龍茭2號莖部各部分均有O2-·的存在，O2-·的分布可能是沿著維管束生長的方向四周分散。

對不同發育階段龍茭2號茭白的基部、中部、尖端進行NBT染色觀察發現（圖2），茭白莖部肉質莖膨大過程中，SOD在不同發育階段各部分均存在活性表達，不同部位NBT著色程度不同，在15 cm長度的茭白莖部中，莖基部及中部著色較深，尖端著色較淺，而在5 cm長度的茭白莖部，莖尖端著色較深。茭白不同發育階段的各部位著色程度不同，說明不同發育階段及不同部位O2-·的分布存在差異。

2.2 SOD活性變化

圖3表明，同一發育時期中，莖中部的SOD活性大多高于基部及尖端。不同發育時期，發育早期（5 cm）SOD活性較高；隨著發育時期的推進，SOD活性先降低后升高；但不同發育期間茭白莖部尖端部分SOD的活性較穩定，且在發育早期SOD活性均高于其他兩個時期。在龍茭2號的3個發育時期中，莖基部、中部及尖端SOD活性變化趨勢均表現為先升后降，與NBT染色觀察結果基本一致。

2.3 過氧化物酶（POD）活性變化

由圖4可以看出，龍茭2號莖部POD活性在發育時期及分布部位中均有差異：同一發育階段的莖中部POD酶活最低、尖部最高；莖部不同發育階段的基部、中部和尖端POD酶活均呈現先降后升的變化趨勢；同一發育階段中尖端POD活性最高、基部次之、中部最低。

圖1 茭白莖部NBT染色的橫切及縱切觀察

圖2 茭白莖部不同發育階段染色觀察

3 討論與結論

茭白是我國除蓮藕外的第二大水生蔬菜，具有重要的經濟價值[8]。目前研究表明，茭白孕茭與茭白黑粉菌的侵染密切相關。茭白組織切片觀察發現，茭白莖部分布著大量的茭白黑粉菌，正常交白莖部黑粉菌以菌絲形態存在，可在薄壁組織細胞間穿梭繞行，也可以直接穿過細胞在莖部伸展[9]。茭白黑粉菌侵染茭白的機制目前尚不明確，但是茭白孕茭過程中黑粉菌的侵染共生必然引發茭白植株產生一系列的防御反應，并在共生孕茭過程中保持一種應急防御平衡。本試驗通過茭白莖部NBT染色觀察發現，茭白莖部存在活性氧的激活及相關的保護酶的表達調控，保護酶染色在莖部各部位均能觀察到，但在維管束周圍顏色較深，可能是維管束周圍的保護酶活性較高。部分保護酶的活性變化可能與茭白黑粉菌侵染相關。

圖3 龍茭2號SOD活性變化

圖4 龍茭2號POD活性變化

病原真菌侵染植株時會引發植物自身的應激防御反應，進而保護植物免受病原真菌侵害，目前針對活性氧暴發等相關應激反應，植物體內形成了2種主要的保護機制，包括酶促和非酶促兩類[10]。研究表明，這2種保護機制在植物體內活性氧的清除和維持中具有重要作用[11]。在茭白的發育過程中，保護酶類如SOD的活性存在明顯的變化，龍茭2號發育早期SOD活性較高、發育中期活性降低，發育后期SOD活性又有所升高，可能與茭白黑粉菌的侵染分布有關。茭白孕茭發育早期，黑粉菌成功侵染茭白植株，引發茭白植株產生應激反應，如活性氧暴發，茭白植株通過對保護酶活性的調控維持體內正常生長所需的活性氧含量，進而導致發育早期SOD活性較高；隨著茭白發育的進行，黑粉菌在茭白莖部膨大的過程中伸展擴散到莖部的各個部位，與茭白維持共生狀態，茭白植株應激反應降低，相關保護酶活性也隨之降低；到了發育后期，茭白莖部停止發育，莖部內黑粉菌數量增多，再一次引發茭白植株的應急防御反應，進而導致相關保護酶活性升高。由此可見，茭白植株相關保護酶的活性變化與黑粉菌侵染密切相關，對其開展進一步研究有助于闡明茭白孕茭過程中茭白植株與黑粉菌的互作機制。

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