草酸脫羧酶的性質(zhì)及應(yīng)用研究進(jìn)展

賀俊斌，林日輝，韋成昱，龍 寒，梁宇薇，陳陽(yáng)陽(yáng)，高 華，杜侶佩

（廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院，化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化過(guò)程新技術(shù)廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530006）

草酸脫羧酶的性質(zhì)及應(yīng)用研究進(jìn)展

賀俊斌，林日輝*，韋成昱，龍 寒，梁宇薇，陳陽(yáng)陽(yáng)，高 華，杜侶佩

（廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院，化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化過(guò)程新技術(shù)廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530006）

草酸脫羧酶（oxalate decarboxylase，Oxdc）屬Cupin蛋白超家族，是一種包含Mn2+的均一聚合酶，能夠在沒(méi)有輔因子的條件下催化草酸轉(zhuǎn)化為甲酸和CO2，是植物、微生物中促使草酸代謝降解的主要酶之一。該酶已在農(nóng)業(yè)、食品、工業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)療和生物監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。本文綜述近年來(lái)在Oxdc來(lái)源、結(jié)構(gòu)、作用以及實(shí)際應(yīng)用方面的研究，著重討論其在泌尿系統(tǒng)草酸鹽結(jié)石病癥方面的作用，為有效預(yù)防治療泌尿系統(tǒng)結(jié)石癥的研究提供理論參考。

草酸；草酸脫羧酶；Cupin蛋白超家族；泌尿系統(tǒng)

草酸（oxalic acid，OA）是自然界中酸性最強(qiáng)的有機(jī)二元羧酸，其分子式是HO2C-C O2H，它能溶于水和乙醇，不溶于乙醚，通常由植物、微生物通過(guò)水解草酰乙酸或氧化乙醛酸、抗壞血酸產(chǎn)生[1]。草酸是一種惰性的代謝終產(chǎn)物，雖然結(jié)構(gòu)極其簡(jiǎn)單，但其既可作為質(zhì)子供體，又可作為電子供體，對(duì)金屬陽(yáng)離子有非常強(qiáng)的螯合性[2]，這些特性使之對(duì)動(dòng)植物、微生物以及人類(lèi)的生產(chǎn)生活產(chǎn)生了不同程度的危害，如造成糧食的減產(chǎn)[3]、蔬菜水果的營(yíng)養(yǎng)缺失、造紙和啤酒工業(yè)管道堵塞[4-5]。同時(shí)，草酸在體內(nèi)的蓄積可產(chǎn)生各種泌尿系統(tǒng)疾病，如腎結(jié)石、尿道結(jié)石和高草酸尿癥[6]等。因此，研究抑制草酸的產(chǎn)生、加速草酸的分解使其水平降低具有重要的科學(xué)和現(xiàn)實(shí)意義。

目前生物界降解草酸的酶包括草酸氧化酶（EC 1.2.3.4）、草酸脫羧酶（EC 4.1.1.2）和草酰輔酶A脫羧酶（EC 4.1.1.8），見(jiàn)圖1。這3 種降解草酸的酶中，由于草酸氧化酶和草酰輔酶A脫羧酶的提取條件苛刻、周期長(zhǎng)，對(duì)酶保藏的穩(wěn)定性有較高的要求，因此不適用于實(shí)驗(yàn)室操作[7]。而Oxdc有廣泛的微生物來(lái)源，提取和反應(yīng)條件要求簡(jiǎn)單，所以得到了廣泛應(yīng)用。

圖1 3種降解草酸的酶Fig.1 Three oxalate-degrading enzymes

草酸脫羧酶（oxalate decarboxylase，Oxdc，EC 4.1.1.2）是一種包含Mn2+的均一聚合酶，屬Cupin蛋白超家族；它可以在沒(méi)有輔因子的條件下催化草酸轉(zhuǎn)化為甲酸和CO2，是植物、微生物中草酸代謝降解的主要催化酶之一[8]。該酶最早由Shimazono[9]發(fā)現(xiàn)于白腐菌中，它主要來(lái)源于黑曲霉、核盤(pán)菌、金針菇和褐腐菌等真菌[10-11]，一些細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了該酶，但動(dòng)物中只在豚鼠（天竺鼠）的肝臟中發(fā)現(xiàn)該酶[12]。枯草芽孢桿菌在低pH值下也能誘導(dǎo)合成Oxdc[13]。基于Oxdc對(duì)底物的高度特異性和酶促反應(yīng)的高效性等特點(diǎn)，該酶已被成功地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、工業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)療等領(lǐng)域中。本文綜述近年來(lái)Oxdc的研究進(jìn)展，重點(diǎn)討論了其在泌尿系統(tǒng)草酸鹽結(jié)石病癥方面的應(yīng)用前景和意義。

1 草酸脫羧酶的性質(zhì)

1.1 理化性質(zhì)

目前為止已經(jīng)分離和提純了10多種不同微生物來(lái)源的Oxdc[11]，并初步研究了它們的生化性質(zhì)。不同來(lái)源的Oxdc蛋白的分子質(zhì)量有較大的差異，但一般都處于55～264 kD范圍內(nèi)。不同微生物來(lái)源的Oxdc的最適反應(yīng)pH值也有較大的差異，但一般都在1.1～3.0之間[14]。研究表明Oxdc的N端結(jié)構(gòu)域主要介導(dǎo)草酸的分解，而C端結(jié)構(gòu)域是否具有催化功能目前還不清楚，但定點(diǎn)突變及高場(chǎng)電子順磁共振光譜方面的證據(jù)表明C端結(jié)構(gòu)域與酶活性的維持密切相關(guān)[15-16]。此外，來(lái)自Collybia velutipes的Oxdc具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和抗去污劑的能力；該酶雖能特異地分解草酸，但對(duì)檸檬酸、醋酸、草乙酸、琥珀酸、蟻酸等都不產(chǎn)生作用[17-18]。

1.2 結(jié)構(gòu)性質(zhì)

隨著生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以及對(duì)Oxdc通過(guò)核磁共振、電子順磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）光譜、晶體衍射和蛋白序列測(cè)定等的研究，對(duì)Oxdc的空間結(jié)構(gòu)特性有了較為深入的研究。Oxdc屬Cupin蛋白超家族的Bicupin亞族，Cupin蛋白具有相同的蛋白質(zhì)前體和三級(jí)結(jié)構(gòu)。Kesarwani等[19]通過(guò)5′-cDNA末端快速擴(kuò)增（5′-rapid-amplification of cDNA ends，5′-RACE）技術(shù)和聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)首次克隆出oxdc基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并通過(guò)cDNA序列在其基因組文庫(kù)中篩選出該酶的基因組克隆，基因序列研究表明，該酶基因大小2.4 kb，與cDNA序列的比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該基因含18 個(gè)外顯子和17 個(gè)內(nèi)含子。所有內(nèi)含子均含保守的5′和3′剪接點(diǎn)，大小為40～60 bp；外顯子為18～300 nt。

目前，來(lái)源于枯草芽孢桿菌的Oxdc已被克隆表達(dá)，對(duì)其空間結(jié)構(gòu)及蛋白序列測(cè)定等的研究較為深入，并獲得了一些高分辨率的晶體結(jié)構(gòu)X射線衍射圖。Anand等[20]通過(guò)對(duì)來(lái)源于Bacillus subtilis的Oxdc的氨基酸序列進(jìn)行測(cè)定和分析，表明該酶大約由379 個(gè)氨基酸殘基組成，是一個(gè)由3 個(gè)Cupin二聚體單體組成的六聚體結(jié)構(gòu)（圖2B）；每個(gè)亞基分子質(zhì)量為43 kD，每個(gè)單體包含兩個(gè)結(jié)合Mn2+的結(jié)構(gòu)域（圖2A），該酶的N端和C端Cupin結(jié)構(gòu)域具有27%的同源性，是由保守的6 股β-折疊形成的桶狀結(jié)構(gòu)，具有相同的Mn2+結(jié)合殘基（由3 個(gè)組氨酸殘基及1 個(gè)谷氨酸殘基構(gòu)成八面體環(huán)境）。其中結(jié)構(gòu)域Ⅰ包含56～233 個(gè)氨基酸殘基，在Mn2+周?chē)Y(jié)合一分子H2O2和一分子甲酸外還結(jié)合4 個(gè)保守的氨基酸His95、His97、His140和Glu101；結(jié)構(gòu)域Ⅱ包含234～379 個(gè)氨基酸殘基，在N端還有一段8～55 個(gè)的氨基酸序列，Mn2+周?chē)Y(jié)合兩分子H2O2外還結(jié)合4 個(gè)氨基酸 His273、His275、His319和Glu280。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中的Mn2+相距大約26 ?[16,20]。之前的研究中Anand等[20]認(rèn)為DomainⅡ是催化活性位點(diǎn)，因?yàn)橹挥性撐稽c(diǎn)的Glu333是質(zhì)子供體。而運(yùn)用分子動(dòng)力學(xué)模擬，研究Oxdc催化產(chǎn)生的CO2是如何從反應(yīng)中心轉(zhuǎn)移到酶分子表面的結(jié)果表明DomainⅠ很可能是該酶的活性位點(diǎn)[21]。此外，研究證明在N端結(jié)構(gòu)域上，由161～165氨基酸殘基構(gòu)成一個(gè)稱(chēng)為蓋子（lid）的五肽環(huán)。蓋子結(jié)構(gòu)決定了催化反應(yīng)過(guò)程酶活性中心的“開(kāi)”、“閉”構(gòu)型，這種蛋白構(gòu)型的轉(zhuǎn)換使Glu-162接近活性中心的Mn2+，Glu-162可能是脫羧反應(yīng)的質(zhì)子供體[22]。蓋子結(jié)構(gòu)還與酶促反應(yīng)的特異性有關(guān)，對(duì)構(gòu)成蓋子的氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，可以使酶的脫羧酶活性轉(zhuǎn)變?yōu)椴菟嵫趸福╫xalateoxidase，OXO）活性[1,15]。最近的研究表明，N末端和C末端結(jié)構(gòu)域都可能具有催化去碳酸基反應(yīng)的能力[23]。

圖2 枯草芽孢桿菌草酸脫羧酶的空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig.2 Structural prediction of Bacillus subtilis Oxdc

2 草酸脫羧酶的催化機(jī)理

根據(jù)Oxdc結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，Anand[20]和Svedru?i?[24]等推測(cè)Oxdc催化脫羧反應(yīng)歷程為：?jiǎn)钨|(zhì)子化的草酸根及氧分子結(jié)合到酶的活性中心上，氧化活性中心的Mn2+轉(zhuǎn)變?yōu)镸n3+，同時(shí)伴隨形成Mn3+結(jié)合的草酸超氧化合物；活性中心谷氨酸殘基介導(dǎo)質(zhì)子偶聯(lián)電子的轉(zhuǎn)移，使起始復(fù)合物形成Mn2+結(jié)合的草酸陰離子自由基；受到金屬離子及活性中心谷氨酸殘基及精氨酸殘基的影響，草酸分子C－C鍵異裂，發(fā)生脫羧反應(yīng)，產(chǎn)生Mn2+結(jié)合的甲酸陰離子自由基；活性中心的谷氨酸殘基質(zhì)子化甲酸陰離子自由基，使電子再次由金屬發(fā)生轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生Mn3+結(jié)合的甲酸根，甲酸根和氧分子解離后，活性中心恢復(fù)為Mn2+。為研究Oxdc的結(jié)構(gòu)域中Mn2+中心的電子性質(zhì)，Campomanes等[25]采用定點(diǎn)突變及密度泛函理論/分子力學(xué)方法評(píng)估了Mn2+中心的EPR精細(xì)結(jié)構(gòu)參數(shù)，建立的方法為運(yùn)用量子力學(xué)法研究與蛋白質(zhì)結(jié)合的金屬離子中心的電子結(jié)構(gòu)特性提供了重要依據(jù)。草酸脫羧反應(yīng)屬于非氧化脫羧反應(yīng)，但分子氧對(duì)于酶的脫羧活性是必需的[26]，目前運(yùn)用膜進(jìn)樣質(zhì)譜法研究在分子氧消耗的條件下NO對(duì)Oxdc催化活性的作用，發(fā)現(xiàn)NO可逆的抑制Oxdc的催化活性，而X頻帶電子順磁共振波譜（X-band EPR）測(cè)定結(jié)果未能直接證明NO與Oxdc中Mn2+中心的相互作用，Mario等[27]認(rèn)為該酶中可能存在一個(gè)隔離的分子氧結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)于Oxdc催化過(guò)程中分子氧的作用，最近研究表明分子氧可能促進(jìn)質(zhì)子耦合電子的轉(zhuǎn)移[28]。

3 草酸脫羧酶的應(yīng)用

3.1 Oxdc在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

Oxdc在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用主要是控制由草酸毒素引起的植物病害，其中以控制由菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）侵染植物的研究備受矚目。Oxdc可以催化草酸轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的甲酸，因此在植物中引入oxdc基因?qū)垢卟菟岱置诜e累造成的植物病害是目前重要的研究方向。隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的植物體基因組中轉(zhuǎn)入了oxdc基因，從而提高了植株對(duì)菌核病的抗性。Kesarwani等[19]運(yùn)用5′-RACE技術(shù)從F. velutipes中擴(kuò)增出oxdc基因，并將此基因轉(zhuǎn)入煙草和番茄中，經(jīng)接種實(shí)驗(yàn)鑒定，發(fā)現(xiàn)表型正常且能夠穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)菌核病具有明顯的抗性。Walz等[29]將來(lái)自云芝（Trametes versicolor）的oxdc基因轉(zhuǎn)入到煙草中后，發(fā)現(xiàn)菌核菌致病過(guò)程中草酸的含量減少，并且減緩了菌核病的擴(kuò)散速率。Dias等[30]運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在萵苣（Lactuca sativa）中轉(zhuǎn)入來(lái)自Flammulina sp.的oxdc基因后，通過(guò)離體葉片接種菌核病菌進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)S. sclerotiorum表現(xiàn)出抗性。Jin Zhaoxia等[31]用表達(dá)Oxdc的Pandorea sp. OXJ-11菌液處理油菜（Brassica napus）的離體葉片，結(jié)果后者表現(xiàn)出抑制菌核病擴(kuò)散的現(xiàn)象。此外，陳曉婷等[32]從已測(cè)序菌株枯草芽孢桿菌中克隆得到oxdc基因Yvrk，并構(gòu)建其植物表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌浸花轉(zhuǎn)化擬南芥，為緩解真菌病害提供了有益的借鑒。最近Cunha等[33]將Flammulina sp.的oxdc基因轉(zhuǎn)入到大豆中，T2代自花授粉所獲得的轉(zhuǎn)基因系通過(guò)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)對(duì)菌核病表現(xiàn)出高抗性；離體葉片接種表明，轉(zhuǎn)基因植株相對(duì)于對(duì)照組都明顯表現(xiàn)出延遲菌核病斑擴(kuò)散的現(xiàn)象；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示oxdc基因的表達(dá)與抗菌核病的能力有關(guān)，轉(zhuǎn)基因植株抗性水平與基因表達(dá)水平成正相關(guān)。通過(guò)從Flammulina velutipes中克隆出oxdc基因（FvOXDC）轉(zhuǎn)入到煙草中，對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草中的草酸含量進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，較對(duì)照組轉(zhuǎn)基因煙草中草酸的含量減少約18%～75%；并對(duì)離體葉片觀察發(fā)現(xiàn)FvOXDC對(duì)由草酸和NLP誘發(fā)的植物程序性死亡表現(xiàn)出明顯的抗性[34]。而舒佳賓[35]從金針菇菌中克隆出oxdc基因，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和植物組織培養(yǎng)技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜，對(duì)成功的轉(zhuǎn)基因苗運(yùn)用葉片離體菌核菌技術(shù)接種后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株具有明顯的延遲和抵御菌核病侵染的能力。最近，Chakraborty等[36]將來(lái)自Flammulina velutipes的oxdc基因轉(zhuǎn)入到番茄后，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄中的草酸含量及營(yíng)養(yǎng)成分如VC、蘋(píng)果酸等分析發(fā)現(xiàn)，與野生型番茄相比，轉(zhuǎn)基因番茄中草酸的減少量高達(dá)90%，而營(yíng)養(yǎng)成分含量也有所增加，從而為提高農(nóng)作物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的研究提供了重要依據(jù)。

3.2 Oxdc在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

草酸的積累形成草酸鹽沉淀而帶來(lái)危害性的影響是工業(yè)生產(chǎn)中的一個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題。尤其是在造紙工業(yè)中，由于其過(guò)程是在封閉系統(tǒng)中進(jìn)行，木質(zhì)纖維素被強(qiáng)氧化劑氧化最終分解為草酸與廢水中的Ca2+結(jié)合造成草酸鈣的沉淀積累，堵塞系統(tǒng)管道，阻塞濾網(wǎng)孔，引起熱能的損失以及循環(huán)水流動(dòng)不暢等問(wèn)題[4-5]。為此，從真菌中提取的Oxdc被廣泛地用于去除造紙過(guò)程中產(chǎn)生的草酸。2011年瑞典制漿造紙研究所Nilvebrant等[37]利用Oxdc處理造紙過(guò)程中的草酸鈣沉積取得了良好的效果。Cassland等[5]發(fā)現(xiàn)從黑曲霉（A. niger）中提取的Oxdc在處理二氧化氯漂白紙漿流程中產(chǎn)生的草酸時(shí)，與植物中提取的草酸氧化酶相比，效果更明顯且不受氯離子的抑制。最近研究發(fā)現(xiàn)來(lái)源于Trametes versicolor的Oxdc在工業(yè)漂白濾過(guò)中的作用較其他草酸降解酶，尤其是較來(lái)源于A. niger的效果更明顯[38]。此外，在啤酒工業(yè)中，利用Oxdc可去除生產(chǎn)過(guò)程中草酸鹽積累產(chǎn)生的沉淀廢物，如啤酒石，從而改善啤酒生產(chǎn)的工藝[39]。

3.3 Oxdc在生物監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

基于Oxdc對(duì)底物的高度特異性，其被廣泛應(yīng)用于測(cè)定各種材料中草酸的含量，Haas等[40]利用來(lái)自F. velutipes中的Oxdc首次成功檢測(cè)了麥芽汁和啤酒中的草酸含量。隨著人類(lèi)草酸尿和泌尿系統(tǒng)草酸鹽結(jié)石發(fā)病率的增加，研究運(yùn)用Oxdc檢測(cè)尿液和血液中草酸含量的方法受到關(guān)注。Vadgama等[41]利用丙烯酰胺凝膠包埋Oxdc與CO2電極結(jié)合研制了Oxdc電極，成功應(yīng)用于檢測(cè)尿液中草酸的含量。Bishop等[42]通過(guò)火焰電離等技術(shù)檢測(cè)Oxdc分解草酸后產(chǎn)生的CO2濃度來(lái)測(cè)定尿液中草酸的濃度，在臨床上得到了應(yīng)用。運(yùn)用酶/生物熒光檢測(cè)技術(shù)結(jié)合來(lái)自F. velutipes中的Oxdc檢測(cè)血漿中草酸的濃度也得到良好的效果[43]。此外，結(jié)合Oxdc和甲酸脫氫酶，聯(lián)合分光光度分析法測(cè)定尿液和血液中草酸的濃度，并且結(jié)合草酸濃度自動(dòng)檢測(cè)分析技術(shù)，在臨床上得到廣泛應(yīng)用[44-46]。隨著研究的深入，Oxdc酶試劑盒及生物傳感器不斷出現(xiàn)，在臨床上得以應(yīng)用，但由于該酶的成本高，阻礙了其推廣和發(fā)展。有研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)Oxdc進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每升發(fā)酵液收獲Oxdc活力1 640 U（約12.33 mg酶蛋白），遠(yuǎn)高于野生菌的誘導(dǎo)表達(dá)量[47]。然而，由于該酶的獲得受發(fā)酵條件如培養(yǎng)基成分、溫度、pH值等的影響，存在產(chǎn)量低、品質(zhì)差等問(wèn)題。因此，在提高Oxdc酶的產(chǎn)量和從新物種中挖掘新的oxdc基因等方面需進(jìn)一步深入研究。

3.4 Oxdc在預(yù)防治療泌尿系統(tǒng)結(jié)石癥方面的應(yīng)用

泌尿系統(tǒng)結(jié)石是一種常見(jiàn)的異常生物礦化現(xiàn)象，根據(jù)地理環(huán)境，生活環(huán)境，遺傳和飲食條件的不同，結(jié)石發(fā)病率在3%～14%之間。此外，治療泌尿系結(jié)石存在的另一個(gè)重要問(wèn)題是復(fù)發(fā)率高，患者在被檢出患泌尿系結(jié)石并經(jīng)過(guò)治療后，短則半個(gè)月，長(zhǎng)至6 年，60%～80%的病人都會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)[48]。泌尿系統(tǒng)結(jié)石形成的主要原因是人們攝入的飲食中含有可形成結(jié)石的相關(guān)成分（草酸）過(guò)多，如葡萄、茶葉、橘子、番茄、菠菜、草莓等都具有較高含量的草酸。研究表明，泌尿系統(tǒng)結(jié)石中大約有70%～80%為草酸鈣結(jié)石[6]。目前雖然這類(lèi)疾病可通過(guò)物理或化學(xué)的方法治療，并取得了一定療效，但結(jié)石的復(fù)發(fā)率高、治療費(fèi)用昂貴，且物理化學(xué)方法對(duì)人體副作用較大。導(dǎo)致草酸鈣結(jié)石的一個(gè)重要原因就是人體內(nèi)缺乏降解草酸的代謝途徑，而生物酶具有作用高效、專(zhuān)一和溫和等特點(diǎn)，因此，采用Oxdc對(duì)人體內(nèi)草酸進(jìn)行降解已成為預(yù)防治療草酸鈣結(jié)石癥的重要研究方向。國(guó)外的阿爾特斯制藥公司運(yùn)用交聯(lián)酶晶體法（cross-linked enzyme crystals，CLECs）制成Oxdc酶制劑用于治療草酸鹽結(jié)石癥，取得了一定的療效[49]。Sidhu等[50]運(yùn)用噴霧干燥法制成重組Oxdc顆粒用于減少胃腸吸收的草酸含量，取得良好效果，可用于預(yù)防和治療高草酸尿癥等。Mufarrij等[51]利用體外實(shí)驗(yàn)設(shè)置不同pH值模擬消化道環(huán)境，研究了Oxdc制劑Oxazyme對(duì)菠菜中草酸的降解能力，與對(duì)照組相比，Oxazyme能顯著降低菠菜中草酸的含量。Grujic等[52]使用基因敲除小鼠為模型，通過(guò)口服交聯(lián)Oxdc晶體（Oxdc-CLEC），有效地防止了小鼠腎鈣質(zhì)沉著癥及尿石癥的發(fā)生。Jeong等[53]模擬高草酸尿癥模型，通過(guò)給小鼠口服來(lái)源于B. subtilis的重組Oxdc，有效的減少了尿液中草酸的水平。Cowley等[54]以大鼠及狗為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，口服酶制劑Oxazyme（OC4）連續(xù)飼喂14 d，評(píng)價(jià)了這類(lèi)用于降解動(dòng)物消化道中草酸的酶制劑的可能毒性，實(shí)驗(yàn)表明均無(wú)可見(jiàn)有害作用水平。此外，在乳酸菌NC8中異源表達(dá)的Oxdc以及在重組L. plantarum WCFS1中利用同源信號(hào)肽誘導(dǎo)異源表達(dá)的Oxdc可被作為益生菌降解腸道內(nèi)飲食中的草酸，以預(yù)防高草酸尿癥的發(fā)生[55-57]。以上這些研究表明，使用Oxdc制劑降解消化道內(nèi)草酸，減少消化系統(tǒng)對(duì)草酸鹽的吸收，從而降低草酸鈣結(jié)石風(fēng)險(xiǎn)的方法是可行的。

但Oxdc用于胃腸道內(nèi)降解草酸時(shí)，容易受胃酸、蛋白酶消化的影響而失去活性，因此，提高該酶在應(yīng)用過(guò)程中的穩(wěn)定性，改善其使用性能是亟待解決的問(wèn)題。為解決這一問(wèn)題，對(duì)該酶進(jìn)行固定化或化學(xué)修飾是一重要研究方向。林日輝等[58-59]提供了一種硫酸銨促進(jìn)Eupergit C250固定化Oxdc的方法，其制備的固定化酶具有較好的操作性能、易于回收重復(fù)使用，可應(yīng)用于食品或造紙等工業(yè)過(guò)程中草酸的降解。運(yùn)用無(wú)載體固定化方法制備交聯(lián)Oxdc聚集體，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)研究表明交聯(lián)Oxdc聚集體的耐酸性、耐熱性、耐胰蛋白酶降解能力較游離酶均有提高[60]。梁躍[61]、韋成昱[62]等研究了右旋糖酐對(duì)Oxdc的化學(xué)修飾，并對(duì)修飾Oxdc的熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性及對(duì)胰蛋白酶抗性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，修飾后酶的性質(zhì)明顯優(yōu)于修飾前。此外，在活體應(yīng)用中，利用Oxdc降解泌尿結(jié)石時(shí)面臨酶蛋白易被稀釋流失的問(wèn)題，對(duì)此本實(shí)驗(yàn)組正在研究對(duì)Oxdc進(jìn)行修飾改性，使之具有對(duì)草酸鈣晶體特異性或較強(qiáng)烈的吸附能力，有效吸附固定于草酸鈣結(jié)晶物上，從而較長(zhǎng)時(shí)間地維持草酸鈣結(jié)石部位酶制劑的濃度，為Oxdc作為預(yù)防、治療結(jié)石的酶制劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供重要參考。

4 結(jié) 語(yǔ)

目前，草酸脫羧酶（Oxdc）基于其對(duì)底物的高度特異性和酶促反應(yīng)的高效性等特點(diǎn)，已被成功地應(yīng)用于農(nóng)作物抗病研究、工業(yè)生產(chǎn)中草酸鹽沉淀的去除以及醫(yī)療等領(lǐng)域中，但對(duì)其研究尚存在許多不足和問(wèn)題。如對(duì)Oxdc的三維空間結(jié)構(gòu)、生理特性等生化性質(zhì)的研究主要是建立在來(lái)源于B. subtilis的Oxdc基礎(chǔ)之上，對(duì)其他物種中的Oxdc研究并不深入；另外，該酶在商業(yè)化應(yīng)用中存在產(chǎn)量低、成本高等缺點(diǎn)。因此，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)等從新物種中挖掘oxdc基因并建立該酶的異源表達(dá)系統(tǒng)，挖掘具備不同生化性質(zhì)的Oxdc，以及通過(guò)生物工程技術(shù)等優(yōu)化產(chǎn)酶條件、提高酶的產(chǎn)量和品質(zhì)以降低成本等方面，還需要更深入的研究。

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Properties and Applications of Oxalate Decarboxylase

HE Junbin, LIN Rihui*, WEI Chengyu, LONG Han, LIANG Yuwei, CHEN Yangyang, GAO Hua, DU Lüpei
(Key Laboratory of New Techniques for Chemical and Biological Conversion Process, School of Marine Sciences and Biotechnology, Guangxi University for Nationalities, Nanning 530006, China)

Oxalate decarboxylase (Oxdc) is a homogenous polymerase with manganese ion and belongs to the Cupin protein superfamily. In plants and microorganisms, Oxdc is one of the main enzymes which can catalyze the decomposition of oxalate into formic acid and CO2without cofactors. It has been applied widely in agriculture, food, industrial process, medical, biological monitoring and other fi elds. In this paper, the source, structure, function and practical applications of Oxdc are reviewed, with particular discussion on the role and advantages of Oxdc in urinary oxalate stones. This will provide important theoretical reference for the effective prevention and treatment of urinary tract stones.

oxalic acid; oxalate decarboxylase; Cupin protein superfamily; urinary system

Q55

A

1002-6630（2015）01-0262-06

10.7506/spkx1002-6630-201501050

2014-03-12

教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目（教外司留[2012]1707號(hào)）；廣西民族大學(xué)科研項(xiàng)目（2013MDYB031）

賀俊斌（1992—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槊腹こ獭-mail：hejunbin556298@163.com

*通信作者：林日輝（1972—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程、酶工程。E-mail：rihuilin@aliyun.com