醒腦通絡(luò)片對腦缺血損傷大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的影響

郭建隊， 田 華， 黃毓娟， 方 瑜

（陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽712046）

醒腦通絡(luò)片對腦缺血損傷大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的影響

郭建隊， 田 華， 黃毓娟， 方 瑜

（陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽712046）

目的 觀察醒腦通絡(luò)片 （黃芪、川芎、桃仁、紅花、雞血藤等）對腦缺血損傷大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的影響。方法 將120只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組 （生理鹽水灌胃），醒腦通絡(luò)片小、中、大劑量組5組，每組各24只，采用線栓法致大鼠腦缺血再灌注損傷模型。腦缺血再灌注后3、7、14、28 d時，神經(jīng)功能評分后處死動物，用免疫組化法觀察缺血側(cè)海馬溴脫氧尿嘧啶核苷 （BrdU）、巢蛋白 （Nestin）的表達(dá)。結(jié)果 假手術(shù)組海馬區(qū)僅有少量BrdU、Nestin陽性細(xì)胞表達(dá)，模型組及醒腦通絡(luò)片各組再灌注3 d后BrdU、Nestin陽性細(xì)胞表達(dá)開始增多，7～14 d達(dá)高峰，28 d明顯下降。和模型組比較，醒腦通絡(luò)片各組BrdU、Nestin陽性細(xì)胞明顯增多 （P＜0.05或0.01）。醒腦通絡(luò)片各組在再灌注14和28 d神經(jīng)功能均顯示恢復(fù)，和模型組比較有顯著性意義 （P＜0.05或0.01）。結(jié)論 醒腦通絡(luò)片可以促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化，可能為其治療缺血性腦血管病的機(jī)制之一。

醒腦通絡(luò)片；腦缺血再灌注損傷；溴脫氧尿嘧啶核苷 （BrdU）；巢蛋白 （Nestin）；神經(jīng)干細(xì)胞；增殖

內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell，NSC）主要存在于成年哺乳動物海馬齒狀回顆粒下層 （subgranular zone，SGZ）和側(cè)腦室室管膜下區(qū)（（subventricular zone，SVZ）［1］。正常情況下，這些神經(jīng)干細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，在病理狀態(tài)時如中風(fēng)、癲癇、帕金森病等，這些細(xì)胞可以增殖、分化、遷移并整合到神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)修復(fù)神經(jīng)功能［2］。缺血性腦血管病發(fā)生后神經(jīng)細(xì)胞再生可以活躍數(shù)天甚至數(shù)周，被認(rèn)為是治療的第二時間窗［3］。用藥物調(diào)控內(nèi)源性NSC的增殖、分化、遷移，促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)就成為當(dāng)前研究的熱點之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)，黃芪、川芎、絞股藍(lán)等中藥的提取物黃芪甲苷［4］、川芎嗪［5］、絞股藍(lán)總苷［6］和參芎滴丸［7］復(fù)方均能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增生。醒腦通絡(luò)片是陜西省名老中醫(yī)楊秀清教授結(jié)合三十多年臨床經(jīng)驗，根據(jù)中風(fēng)病機(jī)以氣虛為根本，漸致臟腑功能、氣血陰陽失調(diào)，氣虛血瘀，痹阻腦脈，腦竅失利組方配伍。其主要組成為黃芪、川芎、桃仁、紅花、雞血藤、地龍、水蛭、女貞子、決明子、冰片。經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院長期臨床實踐證實，醒腦通絡(luò)片是臨床治療缺血性中風(fēng)的有效經(jīng)驗方［8］。以往的研究顯示醒腦通絡(luò)片具有改善微循環(huán)、清除自由基等作用。為進(jìn)一步探索醒腦通絡(luò)片治療缺血性腦血管病的機(jī)理，本實驗觀察醒腦通絡(luò)片對缺血大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞BrdU、Nestin表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 健康SD大鼠120只，雌雄各半，日齡60 d，體質(zhì)量250～300 g，SPF級。購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。動物合格證號SCXK（陜）2012-003。

1.2 藥品及試劑 醒腦通絡(luò)片，陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑中心提供，批號20130320。經(jīng)研磨、生理鹽水溶解，配制成小劑量14.12mg/mL（含生藥0.042 g/mL），中劑量28.24 mg/m L（含生藥0.084 g/mL），大劑量56.48 mg/mL（含生藥0.168 g/mL）的溶液。5-溴脫氧尿嘧啶核苷 （5-bromo-2-deoxyuridin，5-BrdU）（Sigma-Aldrich，美國）；小鼠anti-BrdU單克隆抗體（Sigma-Aldrich，美國）；兔抗巢蛋白（anti-nestin）多克隆抗體（Sigma-Aldrich，美國）。酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒及DAB顯色試劑盒 （武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 實驗儀器 TB-718E型生物組織包埋機(jī)（湖北泰維科技實業(yè)有限公司）；DQP-9010切片機(jī)（上海醫(yī)療儀器廠）；Leica數(shù)碼顯微鏡。

1.4 造模及分組 進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，參照Zea-longa［9］法行線栓法阻斷大鼠大腦中動脈以制作局灶性腦缺血動物模型。造模成功后，隨機(jī)分為假手術(shù)對照組、模型對照組、醒腦通絡(luò)片小、中、大劑量組。假手術(shù)組除實施假手術(shù)外，造模過程同模型組，每組24只大鼠。

醒腦通絡(luò)片3組于術(shù)后24 h開始給予醒腦通絡(luò)片灌胃，每次分別為小劑量組0.28 g/kg、中劑量組0.56 g/kg、大劑量組1.12 g/kg，每天2次，直到處死前1 d。模型組、假手術(shù)組給予生理鹽水（6.7 mL/kg）灌胃。5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-BrdU）用生理鹽水溶解，腹腔注射 （下腹中點旁開1 cm），每組動物于處死前2 d開始給藥，12 h一次，每次50 mg/kg，共3次。

1.5 神經(jīng)病學(xué)評分 參照Zea-longa［9］評分制，即0分，無神經(jīng)功能缺損；1分，提尾懸空不能伸展右側(cè)前爪；2分，行走向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走困難，并向右側(cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，無意識或昏迷。

1.6 腦組織切片制備 模型組和中藥組分別在腦缺血2 h再灌注后3、7、14、28 d各取6只處死取材：腹腔注射10%水合氯醛麻醉，剪開胸腔，充分暴露心臟，經(jīng)左心室插入灌注針至升主動脈，動脈夾固定，剪開右心耳，用生理鹽水200 mL經(jīng)動脈快速灌注，直到肝和肺臟顏色轉(zhuǎn)白及右心房流出液澄清；繼續(xù)用4%多聚甲醛緩沖固定液約200 mL動脈內(nèi)灌注，持續(xù)30 min，至大鼠尾巴和四肢明顯僵硬后，斷頭取腦，標(biāo)本置于4%多聚甲醛緩沖固定液；固定12 h后，腦組織冠狀切開以顯露海馬齒狀回；繼續(xù)固定海馬組織，24 h后將腦組織用酒精脫水，脫水后的標(biāo)本經(jīng)二甲苯透明，透明后的組織常規(guī)石蠟包埋、切片，片厚3μm，并將切片貼在防脫載玻片上，用恒溫烤箱60℃烤片12 h；選取缺血側(cè)海馬區(qū)域的腦組織切片染色，假手術(shù)組取對應(yīng)位置的腦組織切片染色。

1.7 免疫組織化學(xué)方法檢測BrdU、Nestin表達(dá)石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水沖洗，0.01 M PBS浸泡5 min。室溫下，滴加新鮮的3%H2O2孵育10 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶；用0.01 M PBS沖洗，每次5 min，共3次。滴加5%～10%正常山羊血清封閉液，室溫孵育10 min，甩去多余液體，勿洗。滴加一抗50μL，37℃孵育1 h；再用0.01 M PBS沖洗，每次5 min，共3次。滴加生物素化

二抗40～50μL，37℃孵育30 min；最后用0.01 M PBS沖洗，每次5 min，共3次。顯色劑顯色3～15 min（DAB），自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察染色結(jié)果，陽性細(xì)胞呈棕黃色，BrdU定位于細(xì)胞核，Nestin定位于細(xì)胞漿，每只大鼠取缺血側(cè)齒狀回部位切片各3張，每張切片隨機(jī)選取5個非重疊視野，計數(shù)BrdU、Nestin陽性細(xì)胞數(shù)，計算陽性細(xì)胞數(shù)均值 （400倍視野）。

1.8 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。多組數(shù)據(jù)間差異的顯著性分析用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊性檢驗用Levene法，方差齊時用Tukey法，方差不齊時用Games-Howell法檢驗。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺失評分 結(jié)果見表1。假手術(shù)對照組無神經(jīng)功能缺損。醒腦通絡(luò)片各劑量組在再灌注7、14、28 d時，神經(jīng)功能癥狀比模型組明顯減輕，與模型組比較有顯著性差異 （P＜0.05或0.01）。

表1 各組神經(jīng)功能缺失評分比較Tab.1 Comparison of neuro IogicaI function deficit scores in each group

表1 各組神經(jīng)功能缺失評分比較Tab.1 Comparison of neuro IogicaI function deficit scores in each group

注：與同時間點模型組比較，△P＜0.05，■P＜0.01；與同時間點假手術(shù)組比較，●P＜0.01

28 d假手術(shù)組 —組別 劑量/（g.kg-1） 再灌注3 d 再灌注7 d 再灌注14 d 再灌注0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 — 3.17±0.41● 3.00±0.63● 2.17±0.41● 1.50±0.55●醒腦通絡(luò)片組 0.28 2.83±0.41 2.00±0.63△ 1.17±0.75△ 0.50±0.55△醒腦通絡(luò)片組 0.56 2.83±0.41 1.67±0.52■ 0.67±0.52■ 0.33±0.52■醒腦通絡(luò)片組 1.12 2.83±0.41 1.50±0.55■ 0.50±0.55■ 0.17±0.41■

2.2 各組腦缺血再灌注各時間點BrdU陽性細(xì)胞數(shù) 結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠海馬齒狀回SGZ區(qū)有少量BrdU陽性細(xì)胞散在分布，模型組再灌注各時間點缺血側(cè)海馬齒狀回SGZ區(qū)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)比假手術(shù)組明顯增加，與假手術(shù)組比較有顯著性差異 （P＜0.01）。醒腦通絡(luò)片各劑量組再灌注各時間點缺血側(cè)海馬齒狀回SGZ區(qū)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)比模型組缺血側(cè)同部位明顯增加，與模型組比較具有顯著性差異 （P＜0.01），（見表2、圖1，BrdU陽性細(xì)胞細(xì)胞核呈棕黃色，×400）。

表2 各組各時間點BrdU陽性細(xì)胞數(shù)比較Tab.2 Com parison of BrdU positive ceIIs at each time point in each group

表2 各組各時間點BrdU陽性細(xì)胞數(shù)比較Tab.2 Com parison of BrdU positive ceIIs at each time point in each group

注：與同時間點模型組比較，■P＜0.01；與同時間點假手術(shù)組比較，●P＜0.01

28 d假手術(shù)組 —組別 劑量/（g.kg-1） 再灌注3 d 再灌注7 d 再灌注14 d 再灌注10.67±0.82 10.67±1.21 10.50±1.38 10.33±1.21模型組 — 15.17±0.75● 20.33±1.03● 24.33±1.21● 16.33±1.03●醒腦通絡(luò)片組 0.28 17.83±0.75■ 40.00±1.41■ 46.00±1.26■ 19.50±1.05■醒腦通絡(luò)片組 0.56 19.00±0.89■ 43.17±1.47■ 47.33±1.21■ 24.00±1.26■醒腦通絡(luò)片組 1.12 20.17±0.75■ 44.50±1.38■ 52.00±1.41■ 24.17±1.60■

2.3 各組腦缺血再灌注各時間點Nestin陽性細(xì)胞數(shù) 結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)有少數(shù)散在Nestin陽性細(xì)胞，模型組再灌注各時間點Nsetin陽性細(xì)胞數(shù)比假手術(shù)組增加，模型組和假手術(shù)組比較有顯著性差異 （P＜0.05或0.01）。醒腦通絡(luò)片各劑量組再灌注各時間點Nestin陽性細(xì)胞數(shù)比模型組增加，與模型組比較具有顯著性差異 （P＜0.05或0.01），（見表3、圖2，Nestin陽性細(xì)胞胞漿呈棕黃色，×400）。

表3 各組各時間點Nestin陽性細(xì)胞數(shù)比較Tab.3 Com parison of Nestin positive ceIIs at each time poin t in each group

表3 各組各時間點Nestin陽性細(xì)胞數(shù)比較Tab.3 Com parison of Nestin positive ceIIs at each time poin t in each group

注：與同時間點模型組比較，△P＜0.05，■P＜0.01；與同時間點假手術(shù)組比較，○P＜0.05，●P＜0.01

28 d假手術(shù)組 —組別 劑量/（g.kg-1） 再灌注3 d 再灌注7 d 再灌注14 d 再灌注8.00±0.89 8.17±0.75 8.33±0.82 8.00±0.89模型組 — 9.33±0.52○ 12.00±0.63● 13.83±0.75● 11.17±0.75○醒腦通絡(luò)片組 0.28 11.83±0.75■ 14.17±0.75■ 18.17±0.75■ 12.67±0.52△醒腦通絡(luò)片組 0.56 12.50±0.55■ 16.00±0.63■ 22.00±0.89■ 14.50±0.84■醒腦通絡(luò)片組 1.12 12.67±0.52■ 20.00±0.63■ 29.83±0.75■ 16.83±0.98■

圖1 五組腦缺血再灌注14 d后缺血側(cè)海馬區(qū)BrdU染色 （×400）Fig.1 BrdU stainings of the hippocampus ischem ia sides after the 14th day with cerebraIischem iareperfusion in five groups

3 討論

腦血管病因其高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率及高復(fù)發(fā)率的特點，已成為威脅人類健康的主要疾病之一，其中缺血性腦血管病大約占70%。急性缺血性腦血管病的治療目前主要以溶栓、改善腦循環(huán)、保護(hù)腦細(xì)胞治療為主。然而由于有限的治療時間窗，能夠早期溶栓治療的病人很少，而且腦保護(hù)劑的作用有限，因此，目前缺血性腦血管病的治療效果并不理想。神經(jīng)干細(xì)胞（Neural stem cell，NSC）是指能夠分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，并具有自我更新和增殖能力的細(xì)胞［10］。分為內(nèi)源性和外源性兩類，凡是來源于生物體神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的為內(nèi)源性NSC，而從外界導(dǎo)入的神經(jīng)干細(xì)胞為外源性NSC。由于NSC具有不斷增殖、分裂，自我更新、自我維持，多向分化潛能等生物特性，具備神經(jīng)功能修復(fù)的基礎(chǔ)。研究如何用NSC治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病成為目前的熱點。

圖2 五組腦缺血再灌注14 d后缺血側(cè)海馬區(qū)Nestin染色 （×400）Fig.2 Nestin stainings of the hippocampus ischem ia sides after the 14th day w ith cerebra I ischem iareperfusion in five groups

BrdU是胸腺嘧啶核苷的類似物，在細(xì)胞增殖周期的S期競爭摻入細(xì)胞單鏈DNA，被認(rèn)為是細(xì)胞增殖的標(biāo)記物。NSC發(fā)生分裂增殖后，BrdU可作為底物摻入DNA合成，用以標(biāo)記增殖的NSC。研究表明，腦缺血可促進(jìn)成年哺乳動物大腦SVZ區(qū)和海馬齒狀回SGZ區(qū)NSC增殖、分化、遷移，并到達(dá)損傷區(qū)取代部分壞死神經(jīng)元［11-13］。Clausen等研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血損傷后增殖的神經(jīng)干細(xì)胞可遷移到壞死區(qū)周圍，并表達(dá)錐體細(xì)胞標(biāo)志物，這些細(xì)胞可能參與修復(fù)缺損神經(jīng)功能［14］。巢蛋白 （Nestin）是一種特殊的中間絲蛋白，在胚胎神經(jīng)干細(xì)胞開始表達(dá)，當(dāng)神經(jīng)干細(xì)胞遷移、分化基本完成后，其表達(dá)便開始減弱并逐漸停止，最終被其它中間絲蛋白替代［15］。Nestin定位于細(xì)胞質(zhì)，可被nestin抗體特異性識別，是早期未分化狀態(tài)神經(jīng)干細(xì)胞的抗原標(biāo)志，被視為NSC特異性標(biāo)記蛋白，用于神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定［16］。研究顯示，大鼠腦缺血損傷后6 h，海馬區(qū)NSC開始表達(dá)nestin，7 d后達(dá)到高峰，持續(xù)時間4周［17］。近來另有研究發(fā)現(xiàn)，給局灶性腦缺血大鼠頸內(nèi)動脈注入NSC后，NSC

能夠遷移到缺血區(qū)，并存活、分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)功能恢復(fù)明顯優(yōu)于單純注入NSC培養(yǎng)液［18］。這從另一方面說明NSC可以遷移到缺血區(qū)并分化為神經(jīng)元修復(fù)神經(jīng)功能。

本實驗結(jié)果顯示，醒腦通絡(luò)片能夠促進(jìn)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能改善，與模型組再灌注7、14、28 d比較有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05或0.01）。正常成年大鼠腦組織中，海馬齒狀回SGZ區(qū)和SVZ區(qū)只有少量BrdU、Nestin陽性細(xì)胞，缺血性腦損傷后，患側(cè)上述兩區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)生增殖、分化。本實驗顯示，腦缺血再灌注3 d后BrdU、Nestin陽性細(xì)胞開始增加，7～14 d達(dá)到高峰，28 d明顯下降。表明缺血性腦損傷可以誘導(dǎo)內(nèi)源性NSC增殖、分化，這與He等的研究結(jié)果相符［17］。內(nèi)源性NSC在缺血性腦損傷后增殖、分化以及向損傷區(qū)遷移，說明其可能參與了受損神經(jīng)組織修復(fù)，使部分喪失的神經(jīng)功能得以改善。醒腦通絡(luò)片各劑量組均可使BrdU、Nestin陽性細(xì)胞增加，與同時間點模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05或0.01），說明醒腦通絡(luò)片能夠促進(jìn)內(nèi)源性NSC增殖、分化，提示醒腦通絡(luò)片促進(jìn)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損改善可能與促進(jìn)NSC增殖、分化有關(guān)。其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Xingnao Tong Iuo Tab Iets on endogenous neuraIstem ceIIs in rats w ith cerebraIischem ia injury

GUO Jian-dui， TIAN Hua， HUANG Yu-juan， FANG Yu

（Shaanxi Gollege of Traditional Ghinese Medicine，Xianyang 712046，Ghina）

AIM To observe the effectof Xingnao Tongluo Tablets（XNTLT）（AstragaliRadix，Ghuanxiong Rhizoma，Persicae Semen，Garthami Flos，Spatholobi Gaulis，etc.）on endogenous neural stem cells in rats with cerebral ischemia injury.METHODS One hundred and twenty healthy SD ratswere randomly and equally divided into the sham operation control group andmodel group（physiological saline both），low，medium and high-dose XNTLT groups.Middle cerebral artery occlusionmodelwasmade by string ligation.BrdU and Nestin positive cells were observed with immunohistochemistry after ischemia-reperfusion on the 3rd，7th，14th and 28th day，respectively，prior to the assessment of eurologic function score.RESULTS Only few of BrdU and Nestin positive cells were observed in hippocampus of the sham operation group.However，the BrdU and Nestin positive cells of other four groups began to increase on the 3rd day，peaks occurred from the7th to the 14th day and decreased obviously on the 28th day after ischemia-reperfusion.Compared with themodel group，the BrdU and Nestin positive cells significantly increased in the XNTLT groups（P＜0.05 or 0.01）.The neurologic function recovered significantly in the XNTLT groups on the 14th and 28th day after ischemia-reperfusion with significant difference（P＜0.05 or 0.01）.CONCLUSION XNTLT promote the proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells，which may be one of itsmechanisms of action in treating cerebral ischemia.

Xingnao Tongluo Tablets；cerebral ischemia injury；BrdU；Nestin；neural stem cells；proliferation

R285.5

A

1001-1528（2015）11-2352-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.004

2014-12-23

咸陽市科技計劃項目 ［2012k16-01（8）］

郭建隊 （1970—），男，碩士，從事中醫(yī)腦病臨床基礎(chǔ)研究。Tel：18691032725，E-mail：gjd1382@163.com