多糖對抽薹防風藥效及其藥動學的影響

王紫瑋， 楊景明， 姜 華， 陳燕楠， 李紅玉

（遼寧醫學院，遼寧錦州121000）

多糖對抽薹防風藥效及其藥動學的影響

王紫瑋， 楊景明， 姜 華， 陳燕楠， 李紅玉*

（遼寧醫學院，遼寧錦州121000）

目的 研究多糖對抽薹防風 （出現地上莖時采集的防風）藥效及其藥動學的影響。方法 以解熱、鎮痛和抗炎3項指標考察抽薹防風和抽薹防風+多糖兩組對雄性SD大鼠藥效強度差異，并探討其機理。結果 “抽薹防風+多糖”各劑量組均能夠使2，4-二硝基苯酚致熱的大鼠體溫在給藥2 h后明顯降低 （P＜0.05），并持續到給藥后4 h（P＜0.05），而抽薹防風各劑量組無明顯的降溫效果 （P＞0.05）；與空白對照組比較，抽薹防風起效快但維持時間短，抽薹防風+多糖組持續時間長鎮痛作用更為明顯；與模型對照組相比，抽薹防風+多糖組對角叉菜誘導的大鼠足腫抗炎作用效果優于抽薹防風組 （P＜0.05）。抽薹防風+多糖使大鼠體內升麻素含有量顯著高于抽薹防風，兩組比較，差異有統計學意義 （P＜0.01）。結論 多糖在升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷向升麻素轉化過程中發揮了重要作用。

多糖；抽薹防風；藥效學；藥動學

InfIuence of poIysaccharides on pharmacodynam ics and pharm acokinetics of boI-ting Saposhnikoviae Radix

防風為傘形科植物防風Saposhnikovia divaricata的干燥根，是我國常用大宗藥材，最早收載于《神農本草經》，具有解熱、抗炎、鎮痛等作用［1］，有著悠久的應用歷史。防風為一稔植物，即一生只開一次花便因營養枯竭而死亡。因此防風在整個生育周期的幾年內基本都在進行營養生長，只有基生葉，無地上莖。一旦進入生殖生長才出現地上莖（俗稱 “抽薹”），抽薹后的防風質松體輕，因此防風藥材根據不同采收時期可分為 “抽薹防風”和“未抽薹防風”。《中國藥典》規定抽薹防風不能藥用。國家醫藥管理局和中華人民共和國衛生部在1984年制定的 《七十六種中藥材商品規格標準》中把商品防風分為兩個等級，抽薹根空者不收購。有關控制抽薹的方法也已進行了深入的研究［2］，由于技術及管理方面等因素生產中仍有大量的抽薹防風。糖類、脂肪和蛋白質是維持生命活動的三大物質，其中糖類是最主要的物質 （特別是植物）。有研究表明，防風在抽薹過程中的主要色原酮成分并未降低［3］，但藥效明顯降低［4］，這可能與抽薹防風水溶性多糖含有量也較低［5］有關，多糖的含有量可能是導致抽薹防風質量低劣的根本原因。為了進一步證明多糖對抽薹防風藥效的影響，本實驗以抽薹防風為對照，比較加入多糖后解熱、鎮痛、抗炎等藥理作用變化和藥動學差異，從而進一步研究抽薹防風的質量問題，以期擴大防風藥用資源。

1 儀器與材料

1.1 材料 防風、抽薹防風 （黑龍江中醫藥大學）。升麻素對照品 （中國食品藥品檢定研究院，批號0789-10128）。甲醇 （色譜純，天津市光復精細化工研究所）；95%乙醇、石油醚 （分析純，天津市天力化學試劑有限公司）；高氯酸 （分析純，天津市鑫源化工有限公司）；丙酮 （分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；三氟三氯乙烷、D280陰離子交換樹脂 （上海晶純生化科技股份有限公司）；低分子質量肝素鈉注射液 （齊魯制藥有限公司）；三蒸水 （實驗室自制）；2，4-二硝基苯酚（成都西亞化工股份有限公司）；1%角叉菜溶液（上海華藍化學科技有限公司）。

1.2 儀器 L-2000Elite型高效液相色譜儀（日本高新技術集團）；渦旋混合器 （碧云天生物技術研究所），離心機LD4-1.8（北京京立股份有限公司）；旋轉蒸發儀 （上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-三型循環水真空泵 （上海亞榮生化儀器廠）；P202N電子天平 （上海精密科學儀器有限公司）；ZH-YLS-7B型足趾容積測量儀 （淮北正華生物儀器設備有限公司）；YLS-6B型智能熱板儀 （濟南益延科技發展有限公司）；TDB-1型醫用電子體溫計 （東阿阿膠阿華醫療器械有限公司）。

1.3 動物 雄性SD大鼠，體質量 （200±20）g；昆明種小鼠，體質量 （20±2）g，購自大連醫科大學，合格證號為SCXK（遼）2014-0004。

2 供試液的制備

2.1 多糖的制備 取防風切片60 g，加入1 000 m L三蒸水于圓底燒瓶中加熱回流提取2 h，減壓抽濾法過濾殘渣，濾渣再加入1 000 mL三蒸水回流提取2 h，合并兩次濾液，旋轉蒸發儀60℃水浴濃縮水煎液，緩慢加入大約7倍量左右95%乙醇，邊加邊攪拌，靜置過夜。沉淀依次用適量95%乙醇、丙酮、石油醚洗滌，三氟三氯乙烷除蛋白［6］，D280陰離子交換樹脂脫色處理［7］。用Molish反應鑒定有糖的流出后，開始收集洗脫液，至Molish反應呈陰性后停止收集，加入3倍體積的95%乙醇，10 000 r/min、20℃離心10 min，沉淀冷凍干燥，制得防風多糖。

2.2 抽薹防風的制備 取抽薹防風切片120 g，加入1 000 mL三蒸水于圓底燒瓶中加熱回流提取2 h，減壓抽濾法過濾殘渣，濾渣再加入1 000 mL三蒸水回流提取2 h，合并兩次濾液，并精確分成a、b兩等份。將防風多糖加水溶解，置70℃水浴箱內揮發制備過程中殘留的有機溶劑后，加入到上述a溶液中，兩份溶液用旋轉蒸發儀60℃水浴濃縮至等體積240 mL，制得抽薹防風組供試液和含多糖抽薹防風組供試液，相當于0.25 g/mL生藥的混懸液。

3 藥理作用研究

3.1 對2，4-二硝基苯酚致熱大鼠體溫的影響［4］選擇體溫合格，體質量180～220 g的大鼠80只，隨機分為8組，每組10只。分別為空白對照組、模型組、“抽薹防風”和 “抽薹防風+多糖”給藥組，給藥組按照人與大鼠給藥劑量關系，采用高（8 g/kg）、中（4 g/kg）、低（2 g/kg）3種劑量灌胃給藥，空白對照組和模型組灌胃等量蒸餾水。采用2，4-二硝基苯酚致熱后1 h給藥，測定給藥后1、2、3、4 h肛門溫度，計算與正常體溫的差值。采用SPSS 17.0軟件處理，方差分析各組差異，結果以均數±標準差表示。實驗結果見表1。結果表明，與模型對照組比較，在給藥2 h后，“抽薹防風+多糖”各劑量組均出現明顯的降溫作用 （P＜0.05），一直持續到給藥后4 h（P＜0.05），其中中、高劑量組優于低劑量組；而 “抽薹防風”各劑量組均未出現明顯的降溫效果 （P＞0.05）。“抽薹防風+多糖”組解熱作用優于 “抽薹防風”組。

表1 不同劑量 “抽薹防風”組與 “抽薹防風+多糖”組解熱作用Tab.1 Antipyretic actions of varied doses of boIting Saposhnikoviae Radix groups and boIting Saposhnikoviae Radix added w ith poIysaccharides groups

3.2 對小鼠熱板致痛的影響［8］實驗前設定熱板溫度為 （55±0.5）℃，進行痛閾篩選，以放置于熱板上的小鼠出現舔后足所需時間 （s）即為該鼠正常痛閾值。選擇正常痛閾值在 （5～30 s）內的合格小鼠70只，每組10只。分別為空白對照組、“抽薹防風”和 “抽薹防風+多糖”給藥組，給藥組按照人與小鼠給藥劑量的換算關系，采用高 （8 g/kg）、中（4 g/kg）、低（2 g/kg）3種給藥劑量灌胃給藥，空白對照組灌胃等量蒸餾水，觀察并記錄給藥后0.25、0.5、1、1.5、2 h痛閾值。數據采用SPSS 17.0軟件處理，方差分析各組差異，結果以均數±標準差表示。結果見表2。

表2 不同劑量 “抽薹防風”組與 “抽薹防風+多糖”組鎮痛作用Tab.2 AnaIgesic actions of varied dosesof bo Iting Saposhnikoviae Radix groups and boIting Saposhnikoviae Radix added w ith poIysaccharide groups

結果表明，與空白對照組比較，在給藥0.5 h后，“抽薹防風”中、高劑量組均有極明顯的鎮痛作用 （P＜0.01），一直持續到1.5 h（P＜0.01）；“抽薹防風+多糖”各劑量組均在給藥1 h后出現極明顯的鎮痛作用 （P＜0.01），一直持續到2 h（P＜0.01）。在鎮痛作用比較中，“抽薹防風”組起效快、維持時間短；“抽薹防風+多糖”組持續時間長，鎮痛作用明顯。

3.3 對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響［9］將70只大鼠隨機分為7組，每組10只。分別為模型對照組、“抽薹防風”和 “抽薹防風+多糖”給藥組。給藥組按照人與大鼠給藥劑量的換算關系，采用高（8 g/kg）、中（4 g/kg）、低（2 g/kg）3種給藥劑量灌胃給藥，模型對照組灌胃給予等量蒸餾水。給藥30 min后，在各組動物右足足跖底部注射1%角叉菜溶液0.1mL致炎。注射方法是先將大鼠固定，然后拉直右后肢，使用1 mL注射器自足跖中部皮下注射。分別于致炎后1、2、3、4、6 h用足爪儀測定每鼠右后足容積作為基數，根據公式計算其腫脹度，數據采用SPSS 17.0軟件處理，方差分析各組差異，結果以均數±標準差表示。結果見表3。

表3 不同劑量 “抽薹防風”組與 “抽薹防風+多糖”組抗炎作用比較Tab.3 Anti-infIammatory actions of varied doses of boIting Saposhnikoviae Radix groups and boIting Saposhnikoviae Radix added w ith poIysaccharide groups

結果表明，與模型對照組相比，在致炎給藥1 h后，“抽薹防風”組開始發揮療效，對角叉菜誘導的大鼠足腫脹有明顯的抑制作用 （P＜0.05），一直持續到6 h（P＜0.05），其中 “抽薹防風”高劑量組效果最佳；“抽薹防風+多糖”組各劑量在致炎給藥后1 h均使足爪腫脹度降低 （P＜0.05），一直持續到6 h（P＜0.01）。在同等給藥劑量下，“抽薹防風+多糖”組抗炎作用效果優于 “抽薹防風”組。

4 藥動學研究

4.1 動物分組與給藥 將大鼠隨機分為兩組，每組10只，按2.5 g/kg生藥灌胃給藥。

4.2 血液樣品預處理 分別于0、0.5、1、1.5、2、3、5、8、12、24 h眼底靜脈叢取血，置肝素化的離心管中，3 000 r/min離心10 min。取血清各0.1 m L，加入20μL 70%高氯酸，于渦旋混合器上振蕩混勻，將混懸液3 000 r/min離心10 min，取上清液過0.45μm微孔濾膜，濾液進行HPLC分析。

4.3 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（4.6 mm× 200 mm，5μm）；Shim-pack保護柱；流動相為甲醇 （A）-水 （B），梯度洗脫 （0～5min，40%～45%A；5～10min，45%～60%A；10～15min，60%～80%A；15～20min，80%～95%A；20～30min，95%～40%A）；體積流量1.0 mL/min；波長254 nm；柱溫25℃；進樣量20μL。

4.4 方法學評價

4.4.1 檢測方法專屬性 在確定的色譜條件下，升麻素的保留時間為9.747 min，分離情況良好，血漿中的雜質均不干擾。

4.4.2 血液樣品標準曲線 取約10 mg升麻素對照品，精密稱定，放入10 mL量瓶，加甲醇定容，配成1μg/mL的貯備液。分別精密量取該貯備液適量，用甲醇逐級稀釋為0.05、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0μg/mL的升麻素系列標準溶液，置冰箱（4℃）保存。取升麻素系列標準溶液各100μL，置于1.5 mL離心管中，氮氣吹干，分別加入大鼠空白血漿100μL，使大鼠血漿中升麻素的質量濃度分別為 0.05、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 μg/mL，按血漿樣品處理方法操作，進樣20μL進行HPLC分析，對組分質量濃度做標準曲線，得回歸方程為Y=44 939X-322.43，r2=0.999 8。

4.4.3 精密度與準確度 取空白血漿100μL，按“標準曲線制備”項下方法分別配制低 （0.1 μg/mL）、中（1.0μg/mL）、高（3.0μg/mL）質量濃度的質控樣品 （QC），每一質量濃度進行6樣本分析，重復測定3 d。根據當日標準曲線計算樣品的質量濃度，與配制質量濃度對照，采用多次測量的方差分析，求得測定方法的日內精密度的平均RSD分別為3.8%，日間精密度的平均RSD分別為4.0%。

4.4.4 加樣回收率 于已測定防風生藥成分含有量的血漿樣品中分別加入按 “標準曲線的制備”項下制備低（0.1μg/m L）、中（1.0μg/mL）、高（3.0μg/mL）三個質量濃度的QC樣品，每質量濃度進行5樣本分析，按照上述血液樣品預處理方法處理，用標準曲線進行分析。測得加樣回收率為102.3%，RSD為2.4%。

4.4.5 穩定性考察 分別配制低（0.1μg/mL）、中（1.0μg/mL）、高（3.0μg/mL）3種質量濃度的升麻素大鼠血漿樣品，于室溫放置24 h后重新測定，以考察升麻素在樣品測定過程中的穩定性。每一質量濃度進行3樣本分析。測得 RSD為3.7%。同法配制低 （0.1μg/mL）、中 （1.0 μg/mL）、高（3.0μg/mL）3種質量濃度的血漿樣品，經反復3次-20℃冷凍、室溫溶解后測定

樣品濃度，以考察樣品在凍-融循環條件下的穩定性，每濃度進行3樣本分析。測得RSD為3.3%。

4.5 數據處理與統計分析 大鼠灌胃給藥抽薹防風與抽薹加多糖兩組后，各時間點取樣，將經過處理的血清樣品在上述色譜條件下進樣，并計算血藥濃度。血藥濃度-時間曲線見圖1。使用DAS 2.0軟件，采用非房室模型方法處理，達峰時間（Tmax）和達峰濃度 （Gmax）均采用實測值，計算T1/2，AUC0-24h，AUC0-∞，結果以均數±標準差表示。采用SPSS 17.0軟件對藥動學參數進行t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。所得結果見表4。由藥動學參數可看出，兩組藥物平均血藥濃度均在1.5和8 h兩次達到高峰，抽薹防風加入多糖后，半衰期顯著增加，說明升麻素在體內的消除速度明顯減慢。達峰濃度和AUC明顯增加，說明多糖對升麻素的吸收具有促進作用。

圖1 含多糖抽薹防風組與抽薹防風組血藥濃度-時間曲線圖Fig.1 PIasma concentration-time curves for boIting Saposhnikoviae Radix groups and boIting Saposhnikoviae Radix added w ith poIysaccharide groups

表4 抽薹防風組與含多糖抽薹防風組灌胃給藥后藥動學參數Tab.4 Pharmacokinetics parameters of boIting Saposhnikoviae Radix groups and boIting Saposhnikoviae Radix added w ith poIysaccharide groups in rats after intragastric adm inistration

5 討論

抽薹防風藥效較差，加入多糖后，其主要入血成分升麻素血藥濃度明顯提高，各劑量組均能夠使2，4-二硝基苯酚致熱的大鼠體溫明顯降低，明顯提高小鼠熱板法的痛閾值，有效抑制對角叉菜誘導的大鼠足腫脹，且中、高劑量組的藥理作用明顯優于低劑量組。實驗結果表明，防風多糖對防風色原酮成分的吸收和轉化有一定促進作用，血漿中升麻素的量顯著增加，從而有效提高防風的解熱、鎮痛、抗炎作用。

防風藥材中主要含有升麻素、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷3種色原酮成分，但升麻素含有量較低。防風口服給藥后，血液中檢測出的主要成分為升麻素，原型藥升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷卻很難檢測到，它們很可能在體內被轉化為升麻素［10］，而發揮解熱、鎮痛、抗炎的藥理作用。所以本實驗以血漿中升麻素的含有量作為指標性成分。升麻素入血較快，而升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷不易被吸收［11］，血藥濃度-時間曲線中的雙峰現象也證明了升麻素的吸收機制［12］，即口服給藥防風后，升麻素在腸內被直接吸收，從而形成升麻素的第1個血藥濃度高峰；而不易吸收的升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷在腸內被微生物酶解形成升麻素后被吸收，形成升麻素的第2個血藥濃度高峰。由圖1所示，第1個吸收高峰兩組藥物并無太大差異，這也證實了防風抽薹后藥材中的色原酮成分并未減少，而第2個吸收峰二者存在較大差異，抽薹防風加入多糖后入血的升麻素成分較多，且作用持久，說明防風多糖在升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷向升麻素轉化過程中發揮了重要作用。

多糖及糖復合物參與了細胞的各種生命現象的調節［13-15］，防風多糖除具有調節免疫、抗腫瘤等藥效功能外［16］，本實驗又發現了防風多糖對抽薹防風色原酮成分吸收的特殊作用，這為制定出更為合理防風質量評價方法，更加充分利用防風藥材，發揮其最大藥效提供了新的思路。防風多糖對色原酮吸收和代謝的影響機制有待進一步研究，這將對防風多糖功能的認識開拓新的領域。

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WANG Zi-wei， YANG Jing-ming， JIANG Hua， CHEN Yan-nan， LIHong-yu*

（Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，Ghina）

AIM To explore the influence of polysaccharides on the pharmacodynamics and pharmacokinetics of bolting Saposhnikoviae Radix（Saposhnikovia divaricata，picked in appearance of aerial stem）.METHODS

polysaccharides；bolting Saposhnikoviae Radix；pharmacodynamics；pharmacokinetics

R969.1

A

1001-1528（2015）11-2392-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.012

2015-03-20

遼寧省教育廳科學技術研究項目 （L2013330）

王紫瑋 （1991—），女 （蒙古族），碩士生，研究方向為藥物動力學。Tel：18841609255，E-mail：1130936953@qq.com

*通信作者：李紅玉，女，教授，碩士生導師，研究方向為載體栓劑及新藥開發。E-mail：lihongyu@163.com

Three indicators（antipyretic，analgesic and anti-inflammatory action）were examined for the study on the pharmacodynamics difference of bolting Saposhnikoviae Radix and bolting Saposhnikoviae Radix+pdysaccharides formale SD ratsand itspossiblemechanism of action.RESULTS The fever induced by 2，4-dinitrophenolwas reduced by bolting Saposhnikoviae Radix+polysaccharides at 2 h after the administration（P＜0.05），and the antipyretic effect lasted for 4 h after administration（P＜0.05），while bolting Saposhnikoviae Radix（without polysaccharides）demonstrated no significant cooling effect（P＞0.05）.Compared with the control group，bolting Saposhnikoviae Radix displayed both a short response time and a short action duration，while bolting Saposhnikoviae Radix+polysaccharides presented a rapid and prolonged analgesic power.And bolting Saposhnikoviae Radix+polysaccharides wasmuch stronger in relieving rats’paw edema induced by carrageenan than bolting Saposhnikoviae Radix（P＜0.05）.The former broughta higher plasma cimicifugoside concentration than the latterwith a significant statistical difference（P＜0.01）.CONCLUSION Polysaccharides play an important role in converting prim-O-glucosylcimifugin and 5-O-methylvisammioside into cimicifugoside.