穗花杉雙黃酮在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究

王彥志， 張 萌， 劉 陽， 趙會麗， 鄭曉珂

（河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450046）

穗花杉雙黃酮在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究

王彥志， 張 萌， 劉 陽， 趙會麗， 鄭曉珂*

（河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南鄭州450046）

目的 建立測定大鼠血清中穗花杉雙黃酮含有量的方法，并計算其藥動學(xué)參數(shù)。方法 血清樣品甲醇液HPLC分析采用C18色譜柱 （250 mm×4.6mm，5μm）；流動相為乙腈-水 （含0.1%三氟乙酸），梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min；檢測波長330 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量20μL。大鼠灌胃給予穗花杉雙黃酮 （60 mg/kg）后，在不同時間點取血，測定血清中該成分的含有量，并計算其藥動學(xué)參數(shù)。結(jié)果 穗花杉雙黃酮在0.010 04～0.803 2μg/m L范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好 （r2=0.999 1），血清中該成分在各質(zhì)量濃度下的回收率均大于80%，Tmax為90 min，Gmax為（0.469±0.046）μg/mL，AUC0-t為（27.731±1.128）mg/（L.min），AUC0-∞為（24.944±1.093）mg/（L.min），t1/2為（57.008±2.765）min，V/F為（198.36±17.422）L/kg，CL/F為（2.408±0.103）L/（min.kg）。結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于大鼠血清中穗花杉雙黃酮的測定及藥動學(xué)研究。

穗花杉雙黃酮；大鼠血清；藥動學(xué)參數(shù)；HPLC

卷柏為卷柏科植物卷柏Selaginella tamariscina（P.Beauv.）Spring或墊狀卷柏Selaginellaf pulvinata（Hook.&Grev.）Maxim的干燥全草，具有活血通經(jīng)之功效，中醫(yī)臨床常用于治療經(jīng)閉通經(jīng)、癥瘕痞塊、跌撲損傷等癥［1］，其主要有效物質(zhì)為雙黃酮類成分，而其中最主要的是穗花杉雙黃酮（amentoflavone，AME）［2］。目前，國內(nèi)外對穗花杉雙黃酮的抗炎、抗氧化、抗病毒［2］、抗腫瘤［3］、降血糖［4］和擴(kuò)張血管等多種生物活性均有所研究，而且它還具有顯著的抗微生物［5］、抗抑郁及抗焦慮作用［6］。正由于穗花杉雙黃酮具有顯著的藥理活性，故國內(nèi)外正開展針對它的一系列新藥研究。

穗花杉雙黃酮在化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于雙黃酮類化合物，雖然該類成分在自然界的分布非常廣泛，有關(guān)其體內(nèi)代謝的文獻(xiàn)也有不少，但其藥代動力學(xué)研究主要集中在黃酮 （醇）類［7-8］、二氫黃酮 （醇）類［9］、異黃酮類［10-11］、 查爾酮類［12-13］等， 而對雙黃酮類化合物的相關(guān)研究則相對較少。龔雯等［14］對穗花杉雙黃酮在家兔體內(nèi)的藥代動力學(xué)進(jìn)行研究，建立了HPLC法測定家兔血清中該成分濃度的方法，但在處理血清時，需要經(jīng)過一次沉淀和兩次萃取，再吹干溶解，過程相對復(fù)雜，回收率不高，因此有待作進(jìn)一步優(yōu)化。本實驗考察了穗花杉雙黃酮在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)特征，并優(yōu)化血清樣品的處理過程。

1 材料與儀器

1.1 試劑與藥品 甲醇和乙腈均為色譜純 （美國VBS公司）；三氟乙酸為色譜純 （天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙酸乙酯為分析純 （天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；娃哈哈純凈水 （杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。穗花杉雙黃酮對照品 （成都曼思特生物科技有限公司）；穗花杉雙黃酮純品 （自制，純度＞98%）。

1.2 動物 SD大鼠，雄性，體質(zhì)量 （220±20）g（濟(jì)寧市任城區(qū)魯康動物飼料經(jīng)銷中心，許可證號SCXK［魯］20140001）。

1.3 儀器 Waters2695 HPLC色譜儀，包括Waters2489紫外檢測器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；Starsorius BSI電子分析天平（精度0.01 mg，北京賽多利斯天平有限公司）；KQ3200B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TDL-40B離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠）；氮氣吹干儀（北京八方世紀(jì)科技有限公司）；XW-80A渦旋混合儀 （海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈 （A）-水 （B） （含0.1%三氟乙酸），梯度洗脫 （0～5 min，25%A；5～12 min，25%～35%A；12～17 min，35%～45%A；17～25 min，45%～50%A；25～40 min，50%～55%A）；體積流量1.0 m L/min；檢測波長330 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣體積20μL。

2.2 對照品溶液的配制 精密稱取穗花杉雙黃酮對照品10.04 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度

線，配成1.004mg/mL的對照品貯備液，用甲醇稀釋成0.100 4、0.502 0、1.004 0、2.008 0、4.016 0、8.032 0μg/mL一系列對照品溶液，4℃冰箱保存，即得。

2.3 血清樣品預(yù)處理 取血清200μL，置于5 mL離心管中，加入1 mL乙酸乙酯，渦旋混合2 min，超聲1 min，離心5 min（轉(zhuǎn)速4 000 r/min），吸取上層有機(jī)相至另一離心管中，下層血清相重復(fù)萃取一次，合并，40℃空氣流吹干，殘留物用200μL甲醇溶解，取20μL進(jìn)樣分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗 分別取按 “2.3”項下方法制成的大鼠空白和給藥后的血清溶液20μL，注入HPLC色譜儀，在 “2.1”項色譜條件下進(jìn)行測定，結(jié)果見圖1。

由圖可知，該方法處理空白和含藥血清時，色譜條件適宜，樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾穗花杉雙黃酮的測定，專屬性較好。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取大鼠空白血清適量，分別加入按 “2.2”項下方法制得的不同質(zhì)量濃度的穗花杉雙黃酮對照品溶液，渦旋混合，制成血清中含對照品質(zhì)量濃度為0.010 04、0.050 2、0.100 4、0.200 8、0.401 6、0.803 2μg/mL的含標(biāo)血清，按“2.3”項下方法進(jìn)行血清樣品前處理，在 “2.1”項色譜條件下進(jìn)樣分析。以穗花杉雙黃酮的峰面積為縱坐標(biāo) （y），血清中對照品的質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=106 725x+1 023.7，r2=0.999 1，線性范圍0.010 04～0.803 2μg/mL。

2.4.3 精密度試驗 取大鼠空白血清適量，分別加入不同質(zhì)量濃度的穗花杉雙黃酮對照品溶液，渦旋混合，配成低、中、高3個質(zhì)量濃度的樣品進(jìn)行分析，連續(xù)測定3 d，與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時進(jìn)行，按 “2.3”項下方法進(jìn)行血清樣品前處理，進(jìn)樣分析，計算其日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果顯示，該方法精密度良好，符合藥物代謝動力學(xué)研究中的樣品測定要求，見表1。

表1 精密度試驗結(jié)果Tab.1 Resu It of precision tests

表1 精密度試驗結(jié)果Tab.1 Resu It of precision tests

穗花杉雙黃酮/（μg.m L-1）平均值/（μg.m L-1） 日內(nèi)RSD/% 日間RSD/% 0.010 04 0.009 73±0.000 5 2.95 2.87 0.100 4 0.099 5±0.002 5 2.66 2.54 0.803 2 0.789 8±0.003 7 2.13 2.98

2.4.4 回收率試驗 取大鼠空白血清適量，分別加入不同質(zhì)量濃度的穗花杉雙黃酮對照品溶液，渦旋混合，配成低、中、高3個質(zhì)量濃度的樣品，按“2.3”項下方法進(jìn)行血清樣品前處理，進(jìn)樣分析，記錄峰面積RSD，計算相對回收率。另外，配制相同質(zhì)量濃度的穗花杉雙黃酮對照品溶液，進(jìn)樣分析，記錄峰面積RSD，計算兩種峰面積的比值，即絕對回收率。結(jié)果顯示，該方法回收率良好，見表2。

表2 回收率試驗結(jié)果Tab.2 Resu It of recovery tests

表2 回收率試驗結(jié)果Tab.2 Resu It of recovery tests

加入量/（μg.m L-1） 測得量/（μg.m L-1） 相對回收率/% RSD/% 絕對回收率/% RSD/% 0.010 04 0.008 97±0.000 23 89.34±2.29 2.54 80.36±2.32 2.89 0.100 4 0.084 5±0.001 0 84.13±0.99 1.18 79.87±2.06 2.58 0.803 2 0.786 3±0.008 9 97.89±1.11 1.13 86.85±3.26 3.75

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 配制質(zhì)量濃度為0.401 6 μg/mL的含標(biāo)血清樣品，考察其置于4℃冰箱5、15、30 d后的質(zhì)量濃度。結(jié)果，測出平均質(zhì)量濃度為0.390 4μg/m L，RSD為2.41%，表明血清樣品在低溫下放置30 d內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.5 藥動學(xué)研究

2.5.1 試驗方案與血樣采集 稱取穗花杉雙黃酮純品適量，加入含0.1%羧甲基纖維素鈉（CMCNa）的水溶液，超聲混勻，按6 mg/mL的劑量制成混懸液。然后，取SD大鼠5只，灌胃給予混懸液，分別于 0、10、15、30、45、60、90、120、180、240、300、420 min時斷尾取血0.5 mL，置于離心管中離心5 min（轉(zhuǎn)速12 000 r/min），分離血清，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5.2 未知血清樣品的測定 按 “2.3”項下方法進(jìn)行血清樣品前處理，HPLC法進(jìn)行分析。然后測得的數(shù)據(jù)經(jīng)DAS 2.1.1版藥代動力學(xué)軟件處理后，采用非房室模型進(jìn)行擬合，得到穗花杉雙黃酮的藥-時濃度曲線和藥動學(xué)參數(shù) （n=5）。

2.5.3 藥動學(xué)結(jié)果 大鼠灌胃給予穗花杉雙黃酮（60 mg/kg）后，其主要藥物動力學(xué)參數(shù)見表3，平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

表3 藥動學(xué)參數(shù)（n=5）Tab.3 Pharmacokinetics parameters（n=5）

圖2 穗花杉雙黃酮的血藥濃度-時間曲線Fig.2 Serum concentration-time curve for am entofIavone

3 討論

3.1 洗脫條件的選擇 由于檢測的是單一化合物，本實驗前期曾采用等度洗脫，但因血清中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，無法測出穗花杉雙黃酮的確切濃度。因此，根據(jù)文獻(xiàn) ［13］報道，采用梯度洗脫，結(jié)果較為理想，故確定洗脫條件為梯度洗脫。

3.2 給藥量的確定 根據(jù) 《中國藥典》規(guī)定，以成人每次服用江南卷柏10 g的劑量 （按成人體重60 kg算，即0.166 7 g/kg），并根據(jù)人與大鼠的體表面積換算，得出200 g大鼠每次給予卷柏原藥材的量為0.166 7 g（即0.826 7 g/kg），相當(dāng)于穗花杉雙黃酮純品3 mg/kg（所用卷柏藥材中穗花杉雙黃酮的含有量為1.8%）。在預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn)，將此給藥量擴(kuò)大至30 mg/kg后，仍有多個采血時間點的血藥濃度無法測出，故根據(jù)實驗前期對穗花杉雙黃酮降血糖活性量效關(guān)系的考察結(jié)果［6］，將給藥量擴(kuò)大至60 mg/kg。

3.3 藥物的配制 在前期實驗中，發(fā)現(xiàn)穗花杉雙黃酮粉末的脂溶性較強(qiáng)，難溶于水，無法灌胃給

藥，通過查閱文獻(xiàn)，分別應(yīng)用0.1%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）和0.5%吐溫-80配制。結(jié)果顯示，該方法有利于灌胃，而且灌胃劑量準(zhǔn)確可靠。

3.4 血樣預(yù)處理方法的比較 本實驗采用甲醇、丙酮沉淀、乙酸乙酯萃取這3種方法處理血清樣品，發(fā)現(xiàn)用甲醇沉淀蛋白后，雖然空白干擾少，但是回收率較低；用丙酮沉淀蛋白后，回收率較高，但是與空白干擾峰的分離效果不理想；用乙酸乙酯萃取2次后，回收率較高，空白干擾少，操作過程簡單，所以選用乙酸乙酯萃取2次進(jìn)行血樣預(yù)處理。

3.5 藥動學(xué)研究 實驗結(jié)果表明，大鼠口服穗花杉雙黃酮后，在90 min時達(dá)到最高血藥濃度，與文獻(xiàn) ［14］報道的75 min相近，而且表觀分布容積（V/F）為 （198.36±17.422）L/kg，表明大鼠口服穗花杉雙黃酮后，藥物大量分布或儲存在某些組織器官中。

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Pharm acokinetics study on am entofIavone in rats

WANG Yan-zhi， ZHANGMeng， LIU Yang， ZHAO Hui-li， ZHENG Xiao-ke*

（School of Pharmacy，Henan University of Traditional Ghinese Medicine；Gollaborative Innovation Genter for Respiratory Disease Diagnosis and Treatment and Henan Provincial Ghinese Medicine Development，Zhengzhou 450046，Ghina）

AIM To establish amethod for determining amentoflavone in rat serum and calculate its pharmacokinetics parameters.METHODS HPLC analysis of serum methanolic extract of AME was performed on C18column（250 mm×4.6 mm，5μm）with acetonitrile-water（including 0.1%trifluoroacetic acid）asmobile phase at a flow rate of1.0 mL/min，the detection wavelength of330 nm，the column temperature of 30℃and the sample injection volume of 20μL.After intragastric administration of amentoflavone（60 mg/kg），rat serum was collected and checked for the plasma concentration at different intervals，then the pharmacokinetics parameters were obtained.RESULTS Amentoflavone had a good linear relationship within the range of0.010 04-0.803 2μg/mL（r2=0.999 1），whose recovery at different concentrations in rat serum wasmore than 80%，and the Tmax，Gmax，AUC0-t，AUC0-∞，t1/2，V/F and CL/F were 90 min，（0.469±0.046）μg/m L，（27.731±1.128）mg/（L.min），（24.944±1.093）mg/（L.min）， （57.008±2.765）min， （198.36±17.422）L/kg and（2.408±0.103）L/（min.kg），respectively.CONCLUSION This accurate and reliable method can be applied to determining amentoflavone and conduct pharmacokinetics research in rat serum.

amentoflavone；rat serum；pharmacokinetics parameters；HPLC

R969.1

A

1001-1528（2015）11-2397-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.013

2014-12-12

“十二五”國家重大新藥創(chuàng)制科技重大專項 “降糖新藥卷柏黃酮的研究”（2013ZX09102-022）

王彥志 （1976—），女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。Tel：（0371）65962746，E-mail：wangyzlb@126.com

*通信作者：鄭曉珂 （1961—），女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥藥效物質(zhì)作用機(jī)理。E-mail：zhengxk.2006@163.com