硒化紋黨參多糖和其抗A549細胞的活性

陳文霞， 張 培， 高 霞， 白瑞斌， 胡芳弟

（蘭州大學藥學院，甘肅蘭州730000）

硒化紋黨參多糖和其抗A549細胞的活性

陳文霞， 張 培， 高 霞， 白瑞斌， 胡芳弟*

（蘭州大學藥學院，甘肅蘭州730000）

目的 合成硒化紋黨參多糖并探討其抗人肺腺癌細胞A549的活性。方法 以HNO3-Na2SeO3方法硒化紋黨參多糖，在單因素試驗的基礎上，以反應時間、反應溫度、紋黨參多糖與亞硒酸鈉投料比為三因素進行L9（34）正交試驗設計，選擇硒化紋黨參多糖含硒量、產率以及對A549細胞生長的抑制率作為考察指標，優選最佳硒化工藝。結果紋黨參多糖的最佳硒化條件為反應時間5 h，反應溫度60℃，投料比1：1。在此條件下，硒化紋黨參多糖中含硒量可達1.07mg/g（RSD為3.7%），產率可達50.3%（RSD為2.5%），對A549細胞的抑制率可達到49.36%（RSD為2.8%）。結論 硒化紋黨參多糖可以作為抗腫瘤候選藥物。

紋黨參多糖；硒化；正交試驗設計；人肺腺癌細胞A549

硒作為人體必需的微量元素之一，有多種免疫與生物學功能，尤其是它具有預防心血管病、抗腫瘤、抗病毒性疾病以及抗衰老等作用［1］。因此，含硒藥物和添加劑等材料成為當今許多科研人員的研究熱點。有機硒化合物具有吸收率高、生物活性強、毒性低、環境污染小等特點，已成為硒研究的一個方向［2］。目前，國內外在人工合成有機硒化合物方面進行了探索，合成得到了硒化亞油酸、硒化亞麻酸、硒化卡拉膠、硒化蛋氨酸、肌醇硒酸酯、硒化葡聚糖、硒化茶多酚等有機硒化合物，并對其抑制腫瘤的作用進行了初步的研究［3］。因此，利用有潛力的生物活性成分和無機硒制備具有抑制

腫瘤等作用的有機硒化合物具有很大的研究意義。

黨參為桔梗科植物黨參Godonopsis pilosula（Franch.）Nannf.，素花黨參G.pilosula Nannf. var.modesta（Nannf.）L.T.Shen或川黨參G.tangshen Oliv.的干燥根，為我國傳統的補益藥［4］。紋黨參主產于甘肅文縣，是黨參中的上品，其主要品種為素花黨參［5-6］。紋黨參中糖類的含有量普遍較高［7-8］，且可使正常小鼠脾質量增加，胸腺質量減輕，并能逆轉地塞米松所致免疫受抑小鼠的脾質量減輕［9-10］。

以硒多糖作為補硒劑不僅具有合適的穩定性和溶出性能，而且釋放出硒后配體多糖不會對身體產生毒副作用，還能促進金屬離子的吸收和利用［11］。研究證實，硒多糖的藥理活性普遍高于多糖或硒［12］且更容易被機體利用［13-15］。但是除了富硒地區植物中提取的硒多糖量較高外，天然多糖中含硒量極少，遠不能達到補硒要求。因此，采用人工合成的方法對多糖進行硒化修飾為解決以上問題的途徑之一。

本實驗以紋黨參為原料，提取紋黨參多糖（polysaccharides from G.pilosula，PCP），并通過正交設計方法，對黨參多糖硒化合成工藝進行優化。將具有抗癌作用的微量元素硒與活性黨參多糖有機地結合起來，形成硒化紋黨參多糖（polysaccharides from G.pilosula selenide，PCPs），以期獲得既具有強抗腫瘤作用且具有補硒作用的藥物。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑 紋黨參采自甘肅文縣，經過蘭州大學藥學院周印所教授鑒定，為素花黨參G.pilosula Nannf.var.modesta（Nannf.）L.T.Shen的干燥根。按文獻方法提取［16］，黨參藥材粉碎至約60目，加95%乙醇脫脂2 h，殘渣加9倍量體積的水煎煮3次，每次2 h，合并濾液，加入乙醇使得醇體積分數達到75%，放置過夜，離心取沉淀，將沉淀部分冷凍干燥得紋黨參粗多糖（CPP）。

硒粉、亞硒酸鈉 （天津市化學儀器研究所）、硝酸 （優級純）、鹽酸 （優級純）、過氧化氫（30%、優級純）。MTT（Amresco Co，美國）、胰酶（Trypsin 0.25%Solution）、DMEM、新生胎牛血清 （上海創賽）。

人肺腺癌細胞A549、人胃腺癌細胞BGC-823，人宮頸癌細胞HeLa以及人肝癌細胞HepG2由蘭州大學基礎醫學院提供。細胞培養在含有10%胎牛血清，1%雙抗的完全培養基中，環境溫度37℃，濕度95%，含5%CO2。

1.2 儀器與設備 DF-101集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州長城科工有限公司）、Bio-Rad酶標儀（美國Bio-Rad公司）、GI54TR高壓滅菌鍋（廈門致微儀器有限公司）、SW-CJ-1D型超凈工作臺（蘇州蘇泰凈化設備工程有限公司）、Memmert型二氧化碳培養箱 （北京五洲東方科技發展有限公司）、AFS-9800原子熒光光度計 （北京科創海光儀器有限公司）、WX-8000型微波消解系統 （上海屹堯儀器科技發展有限公司）、UV-1700紫外分光光度計 （日本島津公司）、旋轉蒸發儀 （Eyela，日本東京理化）、恒溫水浴箱 （上海一恒儀器有限公司）、冷凍干燥機 （美國Labconco公司）、電子自動分析天平（德國Sartorius公司）、恒溫電熱板（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 單因素試驗 影響硒化多糖的含硒量及產率的因素很多，包括反應溫度、加Na2SeO3的量、反應時間、BaCl2添加量和HNO3的百分含有量等。硒化反應過程如下：稱取100 mg紋黨參多糖于三口燒瓶中，緩慢滴加稀HNO320 mL，邊加邊攪拌，使之完全溶解，加入一定量BaCl2，加Na2SeO30.08 g于70℃下攪拌反應7 h，反應液冷卻后過濾，無水Na2CO3調pH為5～6，加入適量Na2SO3除Ba2+，離心，上清液濃縮后，流水透析2 d，蒸餾水透析1 d，透析液冷凍干燥，得硒化紋黨參多糖（PCPs）。

1.3.1.1 BaCl2添加量對多糖硒化過程影響 硝酸百分含量固定為0.8%，考察加入不同量BaCl2（0、0.1、0.125、0.15、0.175 g）對反應所得的硒化多糖的得率及含硒量的影響。

1.3.1.2 HNO3的百分含量對多糖硒化過程的影響 BaCl2的加入量固定為0.1 g，考察加入20 mL不同百分含量的HNO3（0%、0.5%、0.8%、1.0%、1.5%，0%的硝酸以雙蒸水代替）對反應所得硒化多糖的得率及含硒量的影響。

1.3.2 正交試驗 因在硒化反應中溫度，反應時間以及Na2SeO3的加入量對硒化多糖的產率和含硒量影響較大［17］，在單因素試驗的基礎上將反應時間 （A），反應溫度 （B），投料質量比例 （C）為三因素進行L9（34）正交試驗設計優化條件，因素水平見表1。按“1.3.1”項方法反應得到9個硒化紋黨參多糖，命名為“PCPs1～PCPs9”，試驗結果以含硒量、硒化多糖產率以及硒化多糖對A549細胞的抑制率作為評價指標。

表1 正交設計試驗因素水平Tab.1 Factor IeveIs of orthogonaIdesign test

1.3.3 硒化紋黨參多糖中含硒量的測定 稱取2 mg硒化紋黨參多糖于聚四氟乙烯管中，加入5 mL濃HNO3和1 mL 30%的H2O2，微波消解，消解程序如下：120℃下1 min，150℃下3 min，200℃下5 min，消化結束后，冷卻至室溫。轉移溶液至錐形瓶中，并用電熱板加熱至干，及時加入5 mL濃HCl，當溶液變清澈并伴有白煙時，轉移至25 mL量瓶，并用含5%HCl的蒸餾水定容到25 mL進原子熒光光度計測定。

1.4 硒化紋黨參多糖的抗腫瘤試驗 取處于對數生長期的肺腺癌細胞A549，用胰酶消化，吹打均勻，調細胞密度為5×104個/mL，接種于96孔培養板。每孔100μL，培養至貼壁后加入100μL用無血清培養基配制的CPP和CPPs，使其終質量濃度為25、50、100、200μg/m L，設4個平行孔。調零孔不加細胞懸液，不加藥，只加培養液200μL，對照孔不加藥，只加100μL細胞懸液和100μL培養液，置37℃、5%CO2條件下培養24 h后每孔加入5 mg/mL的MTT 20μL，同樣條件下繼續培養4 h，終止培養。每孔加入150μL DMSO，震蕩10 min，酶標儀檢測吸光值。選擇測定波長570 nm，按下面公式計算細胞生長抑制率。

1.5 驗證試驗 按照上述實驗中得到的最佳條件平行制備硒化紋黨參3份，計算硒化紋黨參的產量和含硒量。硒化紋黨參的抗腫瘤活性通過其對肺癌A549細胞，胃癌BGC-823，宮頸癌HeLa細胞和肝癌HepG2細胞的生長抑制率來驗證。細胞培養和抑制率測定方法同 “1.4”項，以相應質量濃度的紋黨參多糖作為對照。

2 結果與討論

2.1 單因素試驗 如圖1所示，當硝酸體積分數為0.8%固定不變，氯化鋇為0.1 g時，硒化紋黨參多糖的產率和含硒量都達到了峰值，氯化鋇超過0.1 g后產率和含硒量開始下降。當BaCl2用量為0.1 g固定不變時，硒化紋黨參多糖產率和含硒量在HNO3體積分數為1.0%時達到最大值。因此，當黨參多糖量為100 mg時，選擇BaCl2加入量和HNO3的體積分數分別為0.1 g、1.0%。

圖1 硒化紋黨參多糖的單因素試驗Fig.1 SingIe factor test for PCPs

2.2 正交試驗 表2為正交試驗所得到的9個硒化紋黨參多糖產率和含硒量，以及硒化紋黨參多糖在200μg/m L時對A549細胞的抑制率。由結果可知，各因素對硒化多糖含硒量影響的主次順序為B＞A＞C，即反應溫度＞反應時間＞投料比，各因素的最佳水平為A3B1C3，最佳硒化條件為反應時間9.0 h，反應溫度為60℃，投料比為2：2，此時最大含硒量為1.23 mg/g。各因素對硒化紋黨參多糖產率影響的主次順序為C＞B＞A，即投料比＞反應溫度＞反應時間，各因素的最佳水平A2B1C3，即最佳硒化條件為反應時間7.0 h，反應溫度為60℃，投料比為2：2。各因素引起的硒化多糖對A549腫瘤細胞的影響主次順序為C＞B＞A，即投料比＞反應溫度＞反應時間，各因素的最佳水平A1B1C3，即最佳硒化條件反應時間5.0 h，反應溫度為60℃，投料比為2：2。正交試驗結果

表明，反應溫度60℃，投料比2：2為影響硒化紋 黨參多糖含硒量、產率以及抑制率的最佳條件。

表2 正交設計試驗結果Tab.2 Resu It of or thogonaIdesign test

2.3 方差分析 表3～表5為硒化紋黨參多糖含硒量、產率以及硒化紋黨參多糖在200μg/mL時對A549細胞抑制率的方差分析。由表3可知，反應溫度對硒化紋黨參多糖含硒量有顯著影響，反應時間和投料比影響不顯著。由表4可知，投料比對硒多糖產率有顯著影響，反應時間和反應溫度影響不顯著。由表5可知，反應溫度和投料比對硒化多糖的抗腫瘤活性影響極顯著，反應時間影響顯著。由于反應時間對含硒量和產率均無顯著影響，而對腫瘤細胞抑制率具有顯著性影響，選擇反應時間適中的5 h。綜合考慮含硒量和硒多糖產率以及硒化多糖的抗腫瘤活性三個指標的正交試驗和方差分析結果，選擇反應溫度和投料比三者一致的60℃、2：2，確定最佳組合為反應時間5 h，反應溫度60℃，投料比2：2。

表3 含硒量的方差分析Tab.3 ANOVA of seIenium content

表4 產率的方差分析Tab.4 ANOVA of yieId

表5 對A549細胞抑制率的方差分析Tab.5 ANOVA of A549 ceIIs inhibition

2.4 紋黨參多糖及硒化紋黨參多糖的抗腫瘤活性比較 如圖2所示，紋黨參多糖經硒化反應后，對A549細胞的抑制率較未硒化多糖均有不同程度的增加。正交試驗所得到的 9個硒化多糖在200 μg/mL劑量時，對A549細胞的抑制率與未硒化多糖相比，除了PCPs2和PCPs9之外均有顯著性差異，硒化后可提高紋黨參多糖對A549細胞的抑制活性。

圖2 正交設計硒化多糖對A549細胞生長的影響Fig.2 Effects of PCPs on A549 ceIIs grow th

2.5 驗證試驗 取100 mg紋黨參多糖，在正交試驗所得優化條件下進行硒化反應，3次平行實驗，求得在此條件下硒化紋黨參多糖的含硒量為1.07 mg/g（RSD為3.7%），產率為50.3% （RSD為2.5%）。

為了驗證硒化紋黨參多糖對腫瘤細胞生長的影響，將200μg/mL的硒化紋黨參多糖作用于不同的癌細胞 （人肺腺癌細胞A549、人宮頸癌細胞HeLa、人胃腺癌細胞BGC-823和人肝癌細胞HepG2細胞）24 h后發現，相同劑量下硒化紋黨參多糖比紋黨參多糖抗腫瘤作用更強，結果見圖3。硒化紋黨參多糖和紋黨參多糖對A549細胞的抑制率分別為49.36%和15.36%，對BGC-823細胞的抑制率分別為33.2%和24.34%，對HeLa細胞的抑制率分別為40.32%和20.21%，對HepG2細胞的抑制率分別為35.09%和19.3%，硒化紋黨參多糖和紋黨參多糖的抗腫瘤活性的差異可能是由于它們的含硒量差異造成的。此發現表明，紋黨參多糖經硒化修飾后可提高多糖的抗腫瘤活性。

3 結論

硒多糖比單獨的無機硒及多糖具有更顯著的生物活性，在醫藥研制和疾病治療等方面都有廣泛的應用前景［17］。多糖硒化方法較多，如氧化吡啶法、硝酸-亞硒酸鈉（HNO3-Na2SeO3）和乙酸-亞硒酸鈉方法，HNO3-Na2SeO3因反應條件簡單、硒化效率高而成為多糖硒化常用方法［18］。

圖3 硒化紋黨參多糖和紋黨參多糖對不同癌細胞的生長抑制率Fig.3 Inhibition rates of PCPs and PCP on different cancer ceIIs

紋黨參作為黨參中的佼佼者［5］，多糖是其主要的活性成分，表現出一定的提高免疫及抗腫瘤活性［19］。本研究以合成具有較高抗腫瘤活性的黨參硒多糖為主要目標，以甘肅產紋黨參中提取出的多糖為原料，采用HNO3-Na2SeO3方法合成硒化紋黨參多糖，以產率、硒多糖中含硒量及硒多糖抗腫瘤活性為指標，通過單因素試驗和正交試驗設計探討紋黨參多糖硒化的最佳條件，研究發現，影響硒化反應的關鍵因素是反應溫度、多糖與Na2SeO3比率，反應時間影響較小。硒化紋黨參多糖較未硒化紋黨參多糖具有較高的腫瘤生長抑制率，提示硒化紋黨參多糖可以作為抗腫瘤候選藥物。該研究為紋黨參的開發利用提供了思路。

硒多糖的抗腫瘤作用可能與促進癌細胞分化和抑制其分裂有關，一方面硒多糖能調控癌細胞增殖和分裂癌基因的表達，使癌細胞行為向正常轉化，另一方面硒多糖可抑制與細胞癌變密切相關的蛋白激酶C的活性，從而有效抑制癌細胞內蛋白質合成，DNA復制及癌細胞的生長等多種途徑抑制腫瘤細胞活性［20］。有關硒化紋黨參多糖抗腫瘤活性機制有待進一步研究。

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SeIenyIation of poIysaccharides from Codonopsis pilosula and its inhibition against A549 ceIIs

CHENWen-xia， ZHANG Pei， GAO Xia， BAIRui-bin， HU Fang-di*
（School of Pharmacy，Lanzhou University，Lanzhou 730000，Ghina）

AIM To synthesize polysaccharides from Godonopsis pilosula selenide（PCPs）and to explore its anti-tumor activity againsthuman lung adenocarcinoma A549 cells.METHODS PCPswere synthesized by nitric acid-sodium selenide.Based on the single factor experiment，reactive parameters（reaction time，reaction temperature and the ratio of polysaccharide to Na2SeO3）were investigated and optimized by L9（34）orthogonal experimental design in terms of the selenite content，yield and the agent’s inhibitory rate on A549 cells.RESULTS 5 h of reaction time，60℃of reaction temperature and 1：1 ratio of polysaccharide to Na2SeO3were the optimal selenylation conditions.Under the optimal conditions，themean selenium content，yield and inhibitory rate on tumor cell of prepared PCPs reached 1.07 mg/g（RSD=3.7%），50.3%（RSD=2.5%）and 49.36%（RSD=2.8%），respectively.CONCLUSION PCPsmay be a promising antitumor agent.

polysaccharides from Godonopsis pilosula；selenylation；orthogonal experimental design；human lung adenocarcinoma A549 cells

R284.2

A

1001-1528（2015）11-2408-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.015

2015-01-05

蘭州市科技計劃項目 （2013-4-75，2012-2-67）

陳文霞 （1987—），女，碩士生，主要從事植物多糖硒化工藝研究。E-mail：cwx198712@163.com

*通信作者：胡芳弟 （1971—），女，教授，碩士生導師，主要從事中藥成分分離分析及中藥新藥研究。Tel：（0931）8915686，E-mail：hufd@lzu.edu.cn