綜合權重相關分析優選雞血藤抗肝腫瘤組分的提取工藝

潘 虹， 包永睿， 孟憲生*， 王 帥

（1.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術研究中心，遼寧 大連116600；3.遼寧省現代中藥研究工程實驗室，遼寧大連116600）

綜合權重相關分析優選雞血藤抗肝腫瘤組分的提取工藝

潘 虹1，2，3， 包永睿1，2，3， 孟憲生1，2，3*， 王 帥1，2，3

（1.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600；2.遼寧省組分中藥工程技術研究中心，遼寧 大連116600；3.遼寧省現代中藥研究工程實驗室，遼寧大連116600）

目的 優選雞血藤抗肝腫瘤有效組分的提取工藝，為其生產利用提供可靠依據。方法 采用正交設計試驗方法，選取提取時間、料液比、提取次數、乙醇體積分數為考察因素，以藥效為指標，優選提取工藝，再測定總黃酮含有量、芒柄花素含有量和出膏率。然后，通過對這三項指標賦予不同權重所得的多組綜合評分與藥效指標 （細胞抑制率）進行相關度分析，確定能反映藥效的指標及其權重范圍。結果 雞血藤有效組分的最佳提取工藝為50%乙醇加熱回流提取2次，料液比1：30，提取時間1.5 h。總黃酮和芒柄花素含有量的最佳權重系數范圍分別為0.6～1和0～0.4。結論 該工藝條件下，細胞抑制率、總黃酮提取率及芒柄花素含有量均比較高，表明該方法合理、提取工藝穩定可行。

雞血藤；抗肝腫瘤；提取工藝；正交設計；總黃酮；芒柄花素

雞血藤為豆科植物密花豆Spatholobus Suberectus的干燥藤莖，是一味沿用千年的活血化瘀中藥，古代多篇本草論著中都記載了其 “去瘀血，生新血”的功效，并稱之為 “血分之圣藥”［1］，其又名血風、血藤、大血藤、血風藤、三葉雞血藤、九層風、紅藤、活血藤，功效補血、活血、通絡，用于治療月經不調、血虛萎黃、麻木癱瘓、風濕痹痛。現代臨床研究表明，雞血藤具有改善血流量、調節免疫、抗炎、抗腫瘤、抗病毒的功效［2］，其抗腫瘤的有效成分為黃酮、縮合鞣質類化合物［3-4］，也是雞血藤的主要活性物質。目前，有關該植物主要活性組分的最佳提取工藝往往僅以一項指標的含有量為標準，并不能完全反映其藥理藥效，存在片面性。本實驗采用以細胞抑制率為主要指標的正交試驗［5-6］，對總黃酮含有量、出膏率、芒柄花素含有量這三項指標賦予權重系數，得到多組綜合評分，再利用Pearson相關系數法分析綜合評分與抑制率的相關程度，從而分別對三者制定出一個合理的權重系數范圍，避免了人為規定權重系數的主觀性，可為其他藥材提取工藝的優選提供參考。

1 實驗材料

1.1 藥材與試劑 雞血藤 （產地河北，陽光大藥房）。芒柄花素、蘆丁對照品 （中國食品藥品檢定研 究 院， 批 號 分 別 為 110704-200420、100080200707）。乙腈為色譜純 （美國 Tedia公司）；亞硝酸鈉為分析純 （蘇州天申化學有限公司）；氫氧化鈉、無水乙醇均為分析純 （天津市科密歐化學試劑有限公司）；硝酸鋁為分析純 （天津凱信化學工業有限公司）；水為去離子水 （自制）。

1.2 儀器 Agilent1100 HPLC色譜儀，包括DAD檢測器、自動進樣器（美國Agilent Technologies公司）；UV-1750紫外可見分光光度計 （日本島津公司）；MiLLi-Q超純水處理裝置（美國Millipore公司）；Sunrise酶標儀（奧地利Tecan公司）；UAIRETM US Autoflow CO2培養箱（德國Nuaire公司）。

1.3 實驗瘤株 人肝癌細胞株SMMC-7721（上海復蒙基因生物科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 雞血藤的藥效學實驗

2.1.1 細胞培養 人肝癌細胞株SMMC-7721常規培養于10%熱滅活小牛血清的1640培養液 （含青鏈霉素100 U/mL）中，37℃、5%CO2培養箱中連續培養。

2.1.2 含藥培養液的制備 取雞血藤提取液干膏粉末10 mg，溶于5 mL培養液中，加入2‰DMSO助溶，0.22μm微孔濾膜濾過，備用。

2.1.3 MTT試驗 取處于對數生長期的SMMC-7721細胞進行計數，調整細胞密度為5×104個/ m L，接種于96孔培養板中，每孔加入細胞懸液100μL，于37℃、5%CO2飽和濕度下培養24 h，每個正交試驗組設5個復孔，每孔加入MTT（5 mg/mL）20μL，繼續培養4 h。然后，加入DMSO 150μL，孵育10 min后溶解，酶標免疫測定儀測定490 nm處的吸光度 （A）值，計算細胞增殖抑制率［7-9］，公式為增殖抑制率=［（對照組A值-加藥組A值）/對照組A值］×100%

2.2 總黃酮的測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品10.00 mg，置于50 m L量瓶中，加70%乙醇溶解，定容至刻度，搖勻，即得質量濃度為0.2 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 檢測波長的選擇 稱取對照品適量，加70%乙醇溶解，倒入比色皿中，于300～800 nm處進行全波長掃描，最終確定雞血藤總黃酮的最大波長為510 nm。

2.2.3 標準曲線的繪制 精密吸取蘆丁對照品溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，分別置于6個25 mL量瓶中，加入5%亞硝酸鈉 （現配）1 mL，靜置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，再加入4%氫氧化鈉溶液10 m L，加水至刻度，搖勻，靜置15 min。然后，以不加蘆丁的空白試液為參比，于510 nm處測定吸光度［10-11］，以蘆丁的質量濃度 （mg/mL）為橫坐標 （X），吸光度為縱坐標 （Y），繪制標準曲線，

得到回歸方程Y=13.190X-0.009 0，r=0.999 7，表明蘆丁在0.4～1.4 mg范圍內線性關系良好。

2.3 芒柄花素的測定

2.3.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5μm）；流動相為2‰甲酸水溶液（A）-乙腈 （B），等度洗脫 （0～30 min，66%A→34%B）；體積流量1 mL/min；柱溫25℃；檢測波長254 nm；進樣量10μL［12］。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密吸取芒柄花素對照品5.00 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，即得質量濃度為0.5 mg/m L的對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取雞血藤提取液干膏粉末0.3 g，置于10 m L量瓶中，甲醇定容至刻度，0.45μm微孔濾膜過濾，即得。

3 正交試驗

3.1 從抑制率為主指標的正交試驗結果 選取提取時間、乙醇用量、提取次數為考察因素，以細胞抑制率為主要指標，優選提取工藝，結果見表1和表2，可知各因素對提取工藝影響的順序為C＞A＞B＞D。然后，以極值最小的D因素為誤差項進行方差分析，發現A、C具有顯著性影響，通過極差值 （R）大小判定主次因素，通過試驗指標平均值 （K）大小判定最優水平及組合，最終確定最佳提取工藝為A2B2C2D1，即加入30倍量50%乙醇，回流提取2次，每次1.5 h。

表1 抑制率的直觀分析Tab.1 Intuitive anaIysis of inhibition rates

3.2 正交試驗抑制率與綜合評估、相關系數結果以總黃酮含有量、芒柄花素含有量、出膏率為指標，考察因素與抑制率一致，以0.2為間距賦予權重系數，得到一系列綜合評分。然后，以抑制率為核心，利用Pearson相關系數分析對每項指標及每組綜合評分與抑制率的相關度進行分析評價，結果見表3～5。由表可知，當總黃酮含有量和出膏率這兩項指標被賦予的權重系數越大時，綜合評分與藥效指標的相關度就越高。總黃酮含有量與細胞抑制率的相關系數達92.07%，表明其為抗肝腫瘤的主要藥效成分；總黃酮含有量與出膏率的相關系數達96.96%，表明出膏率越高，黃酮含有量越大，同時抑制肝癌細胞生長的能力越強，表明它也是反映藥效的主要指標；芒柄花素含有量與細胞抑制率的相關系數僅為66.54%，表明單以芒柄花素含有量作為優選提取工藝的指標性成分是不合理的。但也有文獻報道將其作為雞血藤有效活性部位的指標性成分［13-14］，故須賦予合理的權重系數方可作為指標。另外，芒柄花素作為提取工藝指標的權重系數范圍為0～0.4，對于總黃酮含有量和出膏率而言，兩者幾乎可以互相替代，若將兩者均作為指標來考察，則其加和范圍為0.6～1，而若只以其中一個作為指標，則可控制在0.6～1之間。

表2 抑制率的方差分析Tab.2 Variance anaIysis of inhibition rates

4 驗證試驗

為了保證提取工藝的藥效，避免操作的復雜性，本實驗基于利用藥效篩選出來的最佳工藝，平行測定雞血藤藥材粉末4份，每份5 g。將總黃酮含有量與出膏率分別在權重范圍內選擇4組權重系數，利用綜合評分與藥效的相關性，對權重范圍的準確性及最佳提取工藝的穩定性進行驗證，試驗結果見表6～7。由表可知，總黃酮與芒柄花素含有量被賦予的權重系數在權重范圍內，其結果與藥效的相關度較高，達到90%以上，但在權重范圍之外時，相關度則較低，只有75%左右。因此，權重系數范圍的選擇是合理的，表明總黃酮與芒柄花素含有量的權重系數在合理范圍內，可代替藥效來優選雞血藤有效組分提取工藝。在本實驗條件下，雞血藤的最佳提取工藝穩定可行，而且藥效學結果穩定。

表3 正交試驗抑制率與綜合評分、相關系數 （1）Tab.3 Com posite scores and the correIation coefficien ts of inhibition rates by orthogonaIexperiments（1）

表4 正交試驗抑制率與綜合評分、相關系數結果 （2）Tab.4 Com posite scores and the correIation coefficients of inhibition rates by orthogonaIexperiments（2）

表5 正交試驗抑制率與綜合評分、相關系數結果 （3）Tab.5 Com posite scores and the correIation coefficien ts of inhibition rates by orthogonaIexperiments（3）

表6 總黃酮與芒柄花素含有量的權重比例Tab.6 W eight ratios of the contents of totaI fIavonoidsand formononetin

表7 抑制率與權重范圍內、外兩組綜合評分的相關度分析Tab.7 CorreIation ana Iysis of the inhibition rates and com posite scores of inside groups and outside groups in the weight range

5 討論

本實驗首先通過正交試驗考察，以細胞抑制率為指標，優選雞血藤有效組分的提取工藝。然后，規律性地賦予各項指標以0.2遞增的權重系數，同時引入Pearson相關性分析方法，能更好地說明兩變量在一定研究范圍內的密切程度。正交試驗綜合評分可探討藥效與化學成分的相關性，確定了能反映藥效的最佳指標為總黃酮和芒柄花素含有量，并計算出每項指標合理的權重范圍。最后，建立以總黃酮含有量為主要指標，芒柄花素含有量為次要指標，結果與以藥效為主指標時較為一致，表明權重范圍的建立是合理的。

通過相關性試驗發現，總黃酮含有量與出膏率這兩項指標可互相取代。為了簡化試驗流程，本實驗只選取了總黃酮與芒柄花素含有量作為指標進行驗證，顯示出膏率在轉移稱量過程中誤差較大。因此，若有更精準的稱量環境，亦可采用出膏率與芒柄花素含有量為指標，優選雞血藤抗肝腫瘤有效組分的提取工藝。

雞血藤化學成分復雜，其提取工藝的研究要以藥效為主要指標才有意義。目前，許多相關報道常以單一成分作為衡量雞血藤有效組分提取工藝的標準，并不能完全與藥效有直接的線性關系，而若以藥效為主要指標考察，則操作耗時復雜，一些單位并不具備進行藥效實驗的條件。因此，為了避免這類情況發生，簡化提取工藝，并確保有效組分被充分提取利用，綜合權重相關分析法不僅彌補了傳統提取工藝的不足，找出可替代藥效并便于測定含有量的其他指標，而且穩定可行，為雞血藤藥材抗肝腫瘤有效組分提取工藝的優選提供了可靠、清晰的應用依據。

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Optim ization of the extraction process of constituents in Spatholobi Caulis in treating Iiver tum orsw ith themethod of com prehensive weighted and correIation anaIysis

PAN Hong1，2，3， BAO Yong-rui1，2，3*， MENG Xian-sheng1，2，3*， WANG Shuai1，2，3

（1.Liaoning University of TraditionalGhinese Medicine，Dalian 116600，Ghina；2.Liaoning Provincial Engineering Research Genter ofGhinese Medicine Ingredients，Dalian 116600，Ghina；3.Liaoning Modern Traditional Ghinese Medicine Research and Engineering Laboratory，Dalian 116600，Ghina）

Spatholobi Gaulis；treating liver tumor；extraction process；orthogonal design；total flavonids；formononetin

R284.2

A

1001-1528（2015）11-2413-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.016

2014-08-05

“十二五”重大新藥創制科技重大專項 （2013ZX09507005）

潘 虹 （1989—），女，碩士，研究方向為藥物分析。Tel：18842654080，E-mail：15840856279@163.com

*通信作者：孟憲生 （1964—），男，博士，教授，博士生導師，研究方向為中藥組分配伍、代謝組學及藥品質量分析。Tel：（0411）85890185