HPLC法同時(shí)測(cè)定紅花注射液中3種活性成分

劉 靜， 趙劍鋒， 馬雙成， 戴 忠*

（1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京100050；2.北京市延慶縣食品藥品監(jiān)督管理局，北京102100）

HPLC法同時(shí)測(cè)定紅花注射液中3種活性成分

劉 靜1， 趙劍鋒2， 馬雙成1， 戴 忠1*

（1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京100050；2.北京市延慶縣食品藥品監(jiān)督管理局，北京102100）

目的 建立同時(shí)測(cè)定紅花注射液中紫丁香苷、羥基紅花黃色素A與（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷3種活性成分的反相高效液相色譜法。方法 紅花注射液0.45μm微孔濾膜濾液分析采用Phenomenex Luna C18色譜柱（4.60mm×250mm，5μm），以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，體積流量1.0mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm。結(jié)果 紫丁香苷、羥基紅花黃色素A與（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷分別在0.101～2.02 μg（r=0.999 6），0.216～4.32μg（r=0.999 7），0.510～10.2μg（r=1）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；平均加樣回收率分別為97.4%、102.3%、100.3%，RSD分別為2.1%、2.1%、1.5%。結(jié)論 本法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，能更好地控制紅花注射液的質(zhì)量。

紅花注射液；紫丁香苷；羥基紅花黃色素A；（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷；HPLC

紅花注射液是由紅花Garthamus tinctorius L.藥材經(jīng)水煮醇沉等工藝加工而成的中藥注射劑，具有活血化瘀功效，用于治療閉塞性腦血管疾病、冠心病和脈管炎，臨床療效顯著。文獻(xiàn)調(diào)研表明，紅花注射液的質(zhì)量控制研究主要集中于羥基紅花黃色素A、腺苷及槲皮素等個(gè)別成分的定量測(cè)定以及特征圖譜研究等方面［1-10］。

為闡明紅花注射液的活性成分，課題組對(duì)紅花注射液化學(xué)成分進(jìn)行了較為深入的研究，同時(shí)采用功效相關(guān)生物活性測(cè)定方法［11-12］，對(duì)其中分離得到的單體成分進(jìn)行了體外抗血小板聚集活性測(cè)試，并報(bào)道除公認(rèn)的羥基紅花黃色素A外，黃酮、多炔苷等成分亦具有較好活性［13］。綜合分析上述研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫丁香苷、羥基紅花黃色素A以及（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-葡萄糖苷在紅花注射液中不僅含有量高、而且活性較好。此外，鑒于紅花注射液現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定項(xiàng)下僅對(duì)羥基紅花黃色素A單一活性成分進(jìn)行測(cè)定的現(xiàn)狀［14］，本實(shí)驗(yàn)旨在建立能夠同時(shí)測(cè)定紅花注射液中紫丁香苷、羥基紅花黃色素A與 （8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷3種活性成分的高效液相色譜法，以便為更好地控制紅花注射液質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀及工作站（美國(guó)Waters公司）；Mettler AE-240電子分析天平（瑞士Mettler公司）；Millipore Synergy-UV超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試藥 紫丁香苷 （批號(hào)111574-200603）、羥基紅花黃色素A（批號(hào)111637-201207）對(duì)照品由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷（自制，純度大于98%）。紅花注射液，批號(hào)分別為13051601、13082002、13082501、 13021502、 13082301、 13062801、13062701、13021701、13082801（規(guī)格均為 10 mL），12040701（企業(yè)小樣）均由A企業(yè)提供。乙腈為色譜純（美國(guó)Thermofischer公司）；磷酸為分析純 （中國(guó)北京化工廠）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Phenomenex Luna C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相A為0.1%磷酸水溶液，B為乙腈，梯度洗脫 （0～20 min，10%～12%B；20～50 min，12%～35%B；50～60 min，10%B）；柱溫30℃；體積流量1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm；進(jìn)樣量為10μL。在上述條件下，樣品中各對(duì)照品與其他組分基本達(dá)到基線分離。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 混合對(duì)照品溶液制備 取對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 m L含紫丁香苷、羥基紅花黃色素A、（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖

苷分別為0.101、0.216、0.510 mg的混合對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

圖1 對(duì)照品與紅花注射液樣品HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and Honghua Injection sam p Ies

2.3 供試品溶液制備 取紅花注射液樣品，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.4 方法學(xué)研究

2.4.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 根據(jù)紫丁香苷、羥基紅花黃色素A以及（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷3種成分的UV光譜圖，設(shè)定265 nm，能夠同時(shí)檢測(cè)3種成分。

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密吸取 “2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液各1、2、5、10、20μL進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回歸方程Tab.1 Regression equations

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。按紫丁香苷、羥基紅花黃色素A、（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷的峰面積計(jì)算RSD值分別為0.2%、0.1%和0.2%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算，結(jié)果樣品中紫丁香苷、羥基紅花黃色素A和（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷的含有量分別為0.050 4、0.161、0.341 mg/mL，RSD分別為1.3%、2.9%、2.5%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，于0、2、4、6、8、12 h按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果樣品中紫丁香苷、羥基紅花黃色素A和（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷在12 h內(nèi)峰面積的RSD分別為0.3%、0.4%和0.2%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知成分含有量的紅花注射液樣品 （12040701）5 mL，平行6份，置10 m L量瓶，分別精密加入混合對(duì)照品溶液（含紫丁香苷0.050 8 mg/mL，羥基紅花黃色素A 0.161 mg/mL，［8Z］-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷0.338mg/mL）5mL，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得，進(jìn)樣20μL，其余色譜條件按 “2.1”項(xiàng)下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Resu Its of recovery tests（n=6）

2.4.7 樣品測(cè)定 取不同批次的紅花注射液，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，進(jìn)樣10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中紫丁香苷、羥基紅花黃色素A及 （8Z）-癸烯-

4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷3種活性成分的量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果（mg/m L）Tab.3 Resu Its of determ ination of samp Ies（mg/m L）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇依據(jù)紫丁香苷、羥基紅花黃色素A與（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷3個(gè)化合物的紫外吸收光譜及其分離度等因素確定為265 nm。

流動(dòng)相分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液等系統(tǒng)，最終選擇分離度較好的乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相。

本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC法同時(shí)測(cè)定了紅花注射液中紫丁香苷、羥基紅花黃色素A與（8Z）-癸烯-4，6-二炔-1-O-β-D-葡萄糖苷3種不同結(jié)構(gòu)類(lèi)型活性成分的量，更好地體現(xiàn)了中藥制劑的多組分特性，為紅花注射液質(zhì)量控制水平的進(jìn)一步提高與完善提供了科學(xué)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)建立的質(zhì)量控制方法對(duì)于紅花注射液的多指標(biāo)控制提供了有益參考。今后通過(guò)多廠家多批次的紅花注射液產(chǎn)品測(cè)定和驗(yàn)證，可以確定上述各成分指標(biāo)的含有量限度，為進(jìn)一步提升為紅花注射液的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

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［14］ WS3-B-3825-98-2012，紅花注射液藥品標(biāo)準(zhǔn)［S］.

Sim u Itaneous determ ination of three active constituents in Honghua Injection by HPLC

LIU Jing1， ZHAO Jian-feng2， MA Shuang-cheng1， DAIZhong1*

（1.National Institutes for Food and Drug Gontrol，Beijing 100050，Ghina；2.Yanqing Gounty Food and Drug Administration，Beijing 102100，Ghina）

AIM To establish a reversed-phase high-performance liquid chromatography（RP-HPLC）method for simultaneously identifying the contents of three major active constituents（sirongoside，hydroxysafflor yellow A and［8Z］-decaene-4，6-diyne-1-O-β-D-glucopyranoside）in Honghua Injection.METHODS The analysis of Honghua Injection filtrate through microporousmembrane was performed on a Phenomenex Luna C18column with acetonitrile and 0.1%phosphoric acid solution asmobile phase in a gradient elutionmanner.The detection wavelength was set at265 nm.RESULTS The calibration curveswere linearwithin the ranges of 0.101-2.02μg for sirongoside（r=0.999 6），0.216-4.32μg for hydroxysafflor yellow A（r=0.999 7）and 0.510-10.2μg for（8Z）-decaene-4，6-diyne-1-O-β-D-glucopyranoside（r=1），respectively.Their average recoveries were 97.4%，102.3%and 100.3%，and RSDswere1.3%，2.1%and 1.5%，respectively.CONCLUSION This accurate，simple and repeatable method provides sound support for the quality control of Honghua Injection.

Honghua Injection（Garthamus tinctorius L.）；sirongoside；hydroxysafflor yellow A；（8Z）-decaene-4，6-diyne-1-O-β-D-glucopyranoside；HPLC

R927.2

A

1001-1528（2015）11-2426-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.019

2015-01-19

中國(guó)食品藥品檢定研究院2012年中青年發(fā)展研究基金課題 （2012A7）

劉 靜，女，博士，副研究員，從事中藥化學(xué)、中藥分析研究。Tel：（010）67095376，E-mail：liujing_zsm@126.com

*通信作者：戴 忠，男，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，從事中藥質(zhì)量控制及中藥化學(xué)對(duì)照品研究。Tel：（010）67095376，E-mail：daizhong@nifdc.org.cn