三水白虎湯含藥血清抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞遷移的初步研究

趙曉峰， 肖長虹， 潘 超， 崔明珠， 李凱芹， 陳恩生

（南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東廣州510515）

三水白虎湯含藥血清抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細胞遷移的初步研究

趙曉峰， 肖長虹*， 潘 超， 崔明珠， 李凱芹， 陳恩生

（南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東廣州510515）

目的 初步探討三水白虎湯 （SSBH）對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 （RA）滑膜成纖維細胞 （SFs）侵襲遷移的影響和可能的機制，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。方法 組織塊培養(yǎng)法獲得類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)SFs并傳代，培養(yǎng)3～5代進行實驗。實驗設(shè)置3組，即：生理鹽水 （NS）空白血清對照組，10%三水白虎湯含藥血清組，sp600125（c-Jun氨基末端激酶信號通路抑制劑）藥物血清組。細胞劃痕實驗觀察RASFs在不同時間點的遷移狀況并計算遷移率，Transwell實驗分不同時間點觀察侵襲情況并統(tǒng)計RASFs對小室膜的穿透數(shù)量；Western blot檢測各組細胞整合素-β1（integrin-β1）的表達水平。結(jié)果 劃痕實驗顯示10%三水白虎湯組、sp600125組劃痕后細胞遷移率較生理鹽水組明顯下降 （P＜0.05），且sp600125組的抑制作用強于三水白虎湯組 （P＜0.05）；Transwell實驗顯示藥物組穿過小室膜的細胞數(shù)明顯減少 （P＜0.05），sp600125組的透膜細胞數(shù)明顯少于三水白虎湯組 （P＜0.05）；三水白虎湯組integrins-β1表達量明顯下調(diào) （P＜0.05），sp600125組與生理鹽水組相比差異無顯著性 （P＞0.05）。結(jié)論 三水白虎湯對RASFs的侵潤遷移有一定的抑制作用，機制可能與下調(diào)細胞遷移相關(guān)蛋白和抑制JNK信號通路有關(guān)。

三水白虎湯；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；成纖維細胞；遷移

大量研究已經(jīng)證實滑膜成纖維細胞（Synovial fibroblasts，SFs）的形成、增殖、遷移在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）的多關(guān)節(jié)炎癥擴展和軟骨骨質(zhì)破壞過程中發(fā)揮重要作用［1-2］。c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號通路是參與RASFs遷移的重要通路之一［3］，故本實驗以 JNK通路的小分子抑制劑sp600125［4］（也稱1，9-Pyrazoloanthrone，1，9-吡唑并蒽酮）為陽性藥物對照。

本課題組前期研究證明，三水白虎湯（Sanshui Baihu Decoction，SSBH）作為臨床治療熱痹為主的關(guān)節(jié)炎經(jīng)驗方，其含藥血清對體外培養(yǎng)的RASFs增殖具有顯著抑制作用［5-7］。三水白虎湯能否影響滑膜細胞的遷移從而阻斷其主動增生是解釋該方治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)作用機制的關(guān)鍵，本實驗旨在初步探討三水白虎湯對RASFs的侵潤遷移能力的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物及處理 SPF級W istar雄性大鼠20只，體質(zhì)量（220±20）g，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物質(zhì)量合格證：SCXK（粵）2011-0074。三水白虎湯由南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供。水煎全方2次，煎取

液濃縮至終質(zhì)量濃度為含生藥2 g/mL。隨機將大鼠分為生理鹽水 （NS）組、三水白虎湯組，每組10只。三水白虎湯組給予2 mL藥液灌胃，生理鹽水組給予等體積的NS，連續(xù)給藥1周后腹主動脈采血，3 000 r/min離心10 min，取血清。水浴滅活補體，0.22μm除菌濾膜除菌后-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 滑膜及細胞培養(yǎng) 滑膜組織來自南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院確診的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的膝關(guān)節(jié) （病情處于活動期，1個月內(nèi)無關(guān)節(jié)腔給藥史），診斷均符合1987年美國風(fēng)濕病協(xié)會修訂的分類標準，患者知情同意。將滑膜組織剪成1 mm3大小，均勻排列于培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面，將瓶身倒置加入適量20%胎牛血清 （FBS）完全培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。孵育2 h待組織塊貼附后，將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)平放繼續(xù)培養(yǎng)。3～4 d鏡下可見組織塊周圍SFs渦旋狀成片生長后，去除組織塊后繼續(xù)培養(yǎng)，待滑膜細胞覆蓋培養(yǎng)瓶底面＞80%時，進行消化傳代。

1.3 劃痕實驗 細胞接種于6孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁后用滅菌20μL槍頭比直尺進行劃痕，棄培養(yǎng)液，PBS清洗3遍，各組按空白血清對照組89%DMEM、10%生理鹽水鼠血清、1%雙抗；三水白虎湯組89%DMEM、10%生理鹽水鼠血清、1%雙抗；sp600125藥物血清組DMSO溶解sp600125（美國Gene Operation公司）后用空白血清對照組培養(yǎng)基調(diào)整終濃度至10μmol/L。分別加入培養(yǎng)液500μL，0、24、48 h觀察細胞遷移情況并在顯微鏡下拍照，利用Image J軟件計算含藥血清培養(yǎng)后細胞遷移的覆蓋區(qū)域面積占起始劃痕面積的百分比。3組各設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.4 Transwell實驗 取指數(shù)生長期的細胞，無血清培養(yǎng)24 h后胰酶消化，DMEM高糖 （含0.1%牛血清白蛋白）制備細胞數(shù)為2×104個/100μL的懸液，分組及培養(yǎng)液同劃痕實驗，各組取200μL到transwell上室（Costar，美國），加600μL相應(yīng)培養(yǎng)液到下室。各組在每個時間段（12、24、36 h）設(shè)3個復(fù)孔，細胞繼

續(xù)培養(yǎng)，取出transwell小室，吸干上室培養(yǎng)液，棉簽擦去上室表面細胞，甲醇固定15 m in，吉姆薩染液染色30 min，清水洗滌多次后，摘取transwell膜，底部朝上晾干，載玻片上中性樹膠封片，在高倍鏡下計數(shù)小室下室膜遷移的細胞數(shù)，計數(shù)中間和四周5個視野，取平均值。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.5 Western blot檢測遷移相關(guān)蛋白表達 各組RASFs以含PMSF的RIPA裂解液（北京Leagene公司）于冰上處理提取總蛋白，BCA試劑盒 （上海貝博生物公司）檢測蛋白濃度定量，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)印和封閉后，孵育integrin-β1兔抗人一抗 （1：500，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）室溫1 h或4℃過夜，洗膜后HRP標記羊抗兔二抗 （1：10 000，北京emarbio公司）室溫孵育2 h，洗膜后DAB顯色，拍照后軟件分析。以β-actin（美國EarthOx，美國）為內(nèi)參，陽性條帶與內(nèi)參光密度 （OD）比值為陽性條帶的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析，方差齊性檢驗后，采用LSD-t檢驗進一步多重比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 劃痕實驗 見圖1、表1。10%三水白虎湯組與sp600125組細胞的愈合均受到一定程度的抑制 （P＜0.05），且sp600125抑制作用強于10%三水白虎湯 （P＜0.05）。同時，藥物組對細胞的抑制作用強度隨著時間增加而增強（r=0.876，P=0.000）。

圖1 各組對RASFs遷移的影響

表1 各組不同時間段細胞遷移率 （愈合面積/原劃痕面積）比較

表1 各組不同時間段細胞遷移率 （愈合面積/原劃痕面積）比較

注：與生理鹽水對照組比較，▲P＜0.05；與10%三水白虎湯組比較，●P＜0.05；與24 h比較，*P＜0.05.

25.76±3.92 56.01±4.63 10%三水白虎湯組 15.37±2.43▲ 45.70±4.01▲*sp600125組 6.63±2.19▲● 28.33±2.40 24 h 48 h生理鹽水對照組分組▲●*

2.2 Traswell實驗 見圖2。與生理鹽水組相比，10%三水白虎湯組與sp600125組細胞穿透小室膜數(shù)量明顯減少，透膜遷移能力受到顯著抑制 （P＜0.05），且sp600125組抑制作用顯著強于10%三水白虎湯組 （P＜0.05），且藥物組抑制作用隨著時間的增加而增強 （r=0.992，P=0.000）。

圖2 各組在不同時間點對細胞穿透能力的影響

2.3 integrin-β1表達 對照β-actin蛋白豐度基本相等情況下，三水白虎湯組的integrin-β1條帶明顯較其他組條帶色

淡 （P＜0.05），如圖3，藥物組蛋白條帶與β-actin密度比值分別為 0.88±0.12、0.71±0.06、0.86±0.10，sp600125組與生理鹽水組差異無顯著性 （P＞0.05），提示三水白虎湯能顯著抑制RASFs表達integrin-β1。

圖3 各組滑膜細胞對integrin-β1的表達情況

3 討論

通過系列研究發(fā)現(xiàn)，三水白虎湯不僅能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-1，MMP-3）、NF-κB mRNA關(guān)節(jié)局部的表達；抑制TNF-α的產(chǎn)生；減少關(guān)節(jié)RASFs內(nèi)p38MAPK的激活和表達，減輕軟骨破壞［5，8-10］。本研究最近發(fā)現(xiàn)，三水白虎湯含藥血清培養(yǎng)RASFs與正常血清培養(yǎng)后的45個差異蛋白中，與細胞遷移密切的黏著斑蛋白和中心體蛋白經(jīng)三水白虎湯培養(yǎng)后表達量明顯減少［11］。本實驗采用經(jīng)典的體外細胞遷移實驗再次證實了三水白虎湯對滑膜細胞遷移具有抑制作用，這可能也是其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥理機制之一。

黏附分子是細胞錨定細胞外基質(zhì) （ECM）進行遷移的主要介質(zhì)，integrin-β1作為與細胞遷移相關(guān)的重要黏附分子，是形成細胞遷移的基礎(chǔ)［12］。Integrin作為將細胞內(nèi)骨架蛋白磷酸化并與細胞外基質(zhì)分子連接起來的主要始動因子，在SFs表面可作為纖連蛋白 （一種主要的ECM成分）的受體，與纖連蛋白結(jié)合后可介導(dǎo)RASFs遷移、黏附于軟骨表面，固定滑膜侵蝕足，并激活胞內(nèi)一系列與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的信號通路如絲裂原活化蛋白激酶 （MAPKs），還可促進前炎癥因子、MMPs合成從而加重基質(zhì)降解［13-14］。本實驗通過檢測發(fā)現(xiàn)三水白虎湯能夠顯著降低滑膜細胞對integrin-β1的表達量，可能通過抑制MAPKs激活和MMPs合成，從而抑制RASFs的遷移。有趣的是，sp600125也可通過抑制JNK（MAPKs家族成員之一）通路來減少MMPs的表達［15］，而在本次實驗中沒有明顯抑制integrin-β1的表達。

那么三水白虎湯在調(diào)節(jié)integrin-β1等細胞遷移相關(guān)蛋白表達過程中是否還具有抑制JNK信號通路的作用，通過提高三水白虎湯濃度能否達到與sp600125同樣的抑制遷移效果，以及明確三水白虎湯復(fù)方中抑制RASFs遷移的組分尚需后期更進一步的挖掘和探討。鑒于RASFs遷移在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中的重要地位，三水白虎湯阻遏其遷移將有助于阻斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞甚至多關(guān)節(jié)傳播，還可避免免疫抑制劑的副作用，具有較高的臨床應(yīng)用價值。參考文獻：

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R285.5

B

1001-1528（2015）11-2508-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.038

2015-04-08

國家自然科學(xué)基金 （81373809）

趙曉峰（1988—），男，碩士，研究方向為風(fēng)濕病學(xué)。Tel：15625065981，E-mail：zxf1988yk@163.com

*通信作者：肖長虹 （1964—），男，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向為風(fēng)濕病學(xué)。Tel： （020）61650115，E-mail：chnghngxiao@aliyun.com