和厚樸酚-PLGA納米粒含量及包封率的測定

王國強， 林嘉成， 楊 帆， 班俊峰， 鄧廣漢， 呂竹芬*

（1.廣東省藥物新劑型重點實驗室廣東藥學院藥物研究所，廣東廣州510006；2.廣東藥學院藥科學院，廣東廣州510006；3.廣東藥學院圖書館，廣東廣州510006）

和厚樸酚-PLGA納米粒含量及包封率的測定

王國強1， 林嘉成1， 楊 帆2， 班俊峰3， 鄧廣漢1， 呂竹芬1*

（1.廣東省藥物新劑型重點實驗室廣東藥學院藥物研究所，廣東廣州510006；2.廣東藥學院藥科學院，廣東廣州510006；3.廣東藥學院圖書館，廣東廣州510006）

目的 建立和厚樸酚-PLGA納米粒含有量及包封率的測定方法。方法 HPLC法測定納米粒中和厚樸酚的含有量，透析法從和厚樸酚-PLGA納米粒中分離和厚樸酚，然后計算其包封率。結果 乙腈溶解后應用超聲法從納米粒中提取和厚樸酚，測定條件為流動相甲醇-水（78：22）；檢測波長294 nm；體積流量1.0 mL/min。測得平均包封率為62.51%。結論 HPLC法準確可靠，而且透析法與離心法、葡聚糖凝膠柱色譜法相比，更適合測定和厚樸酚-PLGA納米粒的包封率。

和厚樸酚；PLGA；納米粒；包封率；HPLC；透析

和厚樸酚（Honokiol，H）是從木蘭科植物厚樸中萃取出的帶有烯丙基的連苯二酚類小分子化合物，近年研究表明，其具有良好的抗腫瘤活性，可抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞分化，逆轉腫瘤多藥耐藥性，抑制腫瘤轉移和新生血管形成［1-2］。然而，和厚樸酚在體內的消除半衰期很短，僅為3.3 h［3］，并且有水溶性低和易被氧化降解的缺點［4-5］，大大降低了其在體內的吸收和生物利用。聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactide-co-glycolide）acid，PLGA］是經FDA認證的具有生物可降解和良好生物相容性的高分子材料，以其作為和厚樸酚納米粒的載體材料，不但可提高藥物穩定性，還能使藥物緩慢釋放，延長其在體內的循環時間和半衰期，提高生物利用度［6-7］。

本實驗以PLGA為載體材料制備和厚樸酚納米粒，然后建立HPLC法測定納米粒中和厚樸酚的含有量，再分別采用透析法、離心法和葡聚糖凝膠柱色譜法測定其包封率。

1 儀器與試劑

e2695-2489型HPLC色譜儀（美國Waters公司）；磁力攪拌器 （德國IKA公司）；5810R型高速離心機 （德國Eppendorf公司）；CP 225 D型電子分析天平（德國Sartorius公司）。和厚樸酚對照品 （LOT 110730-201112，中國食品藥品檢定研究院）；和厚樸酚 （LOT130701，廣州晶晶生物科技有限公司）；聚乳酸羥基乳酸共聚物 （PLGA75：25，相對分子質量10 000，山東省醫療器械研究所）；聚乙烯醇（PVA 4-88，相對分子質量約31 000，德國Sigma-Aldrich公司）；G-50葡聚糖凝膠（美國Pharmacia公司）；透析袋（分子截留量7 000～14 000，美國Viskase公司）。甲醇為色譜純（美國Labscience公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 和厚樸酚PLGA納米粒的制備 參考文獻 ［8］，采用自乳化溶劑揮發法制備。室溫下將和厚樸酚5 mg，PLGA 50 mg溶于丙酮-乙醇 （8：2）混合溶液中，形成有機相，2% PVA溶液20mL為水相，在500 r/min磁力攪拌下，將有機相緩慢注入水相中，繼續攪拌4 h，揮去有機溶劑，制得帶有藍色乳光的乳液，將其稀釋適當倍數，采用Delsa Nano C納米粒度儀測定其粒徑分布。結果顯示，和厚樸酚PLGA納米粒乳液平均粒徑為 （195±11）nm，多分散系數為0.12±0.03，見圖1。

圖1 和厚樸酚PLGA納米粒的粒徑分布

2.2 和厚樸酚PLGA納米粒含有量的測定

2.2.1 色譜條件 DIONEX-ACCLAIM.120 C18色譜柱（250mm×4.6 mm，5μm）；甲醇-水 （78：22）為流動相；檢測波長294 nm；柱溫30℃；體積流量1.0 mL/min；進樣量20μL。

2.2.2 線性關系考察 精密稱取和厚樸酚對照品10.04 mg，置于50 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，得到質量濃度為200.8μg/mL的貯備液。然后，精密量取貯備液適量，分別用甲醇稀釋成質量濃度為 0.251、0.502、1.004、5.02、10.04、20.08、50.2、100.4μg/mL的系列對照品溶液，在 “2.1”項色譜條件下進樣測定，以峰面積 （Y）對質量濃度 （X）進行線性回歸。得回歸方程Y=30 234X+ 13 052（r=0.999 6）。結果表明，藥物質量濃度在0.251～100.4μg/mL范圍內呈良好的線性關系，檢測限按信噪比3：1，計為0.13 ng/mL；定量限按信噪比10：1，計為0.43 ng/mL。

2.2.3 專屬性試驗 分別以對照品、樣品和空白納米粒進樣測定，記錄色譜圖 （圖2），表明處方中輔料對樣品測定無干擾。

圖2 專屬性色譜圖

2.2.4 儀器精密度試驗 取“2.2.2”項下20.08μg/mL對照品溶液，連續進樣6次，記錄峰面積，測得 RSD為0.10%，表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復性試驗 精密量取和厚樸酚PLGA納米粒1 mL，平行配制供試品溶液6份，計算含有量。結果，平均含有量為249.34μg，RSD為0.43%。表明該方法重復性良好。

2.2.6 樣品穩定性試驗 取 “2.2.5”項下供試品溶液，分別于0、1、2、4、8 h進樣測定，測得峰面積RSD為0.32%，表明供試品溶液在8 h內穩定。

2.2.7 回收率試驗 精密量取3份 “2.1”項下同一批和厚樸酚PLGA納米粒0.5 mL，置于10 m L量瓶中，分別加入200.8μg/mL對照品溶液0.4、0.5、0.6 mL，平行配制供試品溶液3份，進樣測定，測得平均回收率為98.19%（RSD為1.61%），見表1。

2.2.8 耐用性 分別采用不同品牌的HPLC色譜儀（Waters、Agilent和Dionex）以及C18色譜柱（Waters和Dionex），其他色譜條件不變，對同一份樣品進行測定。結果發現，色譜圖無明顯差異，說明該方法對不同儀器、品牌色譜柱的耐用性較好。

表1 回收率試驗測定結果

2.2.9 和厚樸酚含有量的測定 分別精密量取和厚樸酚PLGA納米粒3批，每批1 mL，乙腈溶解，100W下超聲5 m in，乙腈稀釋至10 mL，過濾，取續濾液進樣測定，按外標法計算。另取和厚樸酚對照品溶液適量，按相同方法進樣測定。結果，3批供試品中和厚樸酚的質量濃度分別為262.82、259.18、258.15μg/mL。

2.3 包封率測定 本實驗采用透析法［9］測定和厚樸酚PLGA納米粒的包封率。

2.3.1 平衡時間的確定 精密量取和厚樸酚PLGA納米粒2 mL，置于透析袋中，兩端扎緊，放入40%乙醇溶液25 m L中，37℃下振搖24 h（150 r/min），分別于0、2、4、8、12、16、20、24 h吸取透析介質2 mL（同時補充等體積透析介質），過濾后按 “2.2”項下方法進樣測定，藥物濃度隨透析時間的變化曲線見圖3（n=3）。由圖可知，峰面積在20 h后趨于平穩，說明游離藥物在20 h后已達到透析平衡，即使延長透析時間也不會增加游離藥物的濃度，故確定透析時間為20 h。

圖3 藥物濃度隨時間變化曲線

2.3.2 透析法回收率試驗 精密稱取和厚樸酚對照品適量，加40%乙醇溶液配制成質量濃度為49.60、98.70、202.60μg/mL的溶液，精密量取2mL，置于透析袋中，按“2.3.1”項下方法振搖20 h，取透析介質，過濾，計算回收率，結果見表2。由表可知，游離藥物能自由穿過透析袋，使藥物濃度在透析袋內外兩側達到平衡，從而準確計算包封率。

表2 透析法回收率試驗結果 （n=3）

2.3.3 透析法測定包封率 精密量取和厚樸酚PLGA納米粒2mL，置于透析袋中，按 “2.3.1”項下方法振搖20 h，吸取適量透析介質，過濾后進樣測定游離藥物量M游離，再按“2.2.9”項下方法測定和厚樸酚PLGA納米粒中總含藥量M總，計算公式為包封率=［（M總-M游離）/M總］×100%。結果，其平均包封率為62.51% （n=3）。

3 討論

3.1 色譜條件及溶劑的選擇 PLGA和聚乙烯醇對納米粒中和厚樸酚的測定無干擾，故選擇 《中國藥典》2010版中HPLC條件測定其含有量。在篩選溶解PLGA納米粒的溶劑時，本實驗曾使用乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷等，但最終選擇乙腈，因為它不但能很好地溶解PLGA，同時還可與水互溶，對和厚樸酚也有良好的溶解性。

3.2 包封率測定方法的選擇

3.2.1 離心法 本實驗曾通過改變離心轉速 （8 000、12 000、15 000 r/min）和離心時間 （30、60、90 min），用于篩選將納米粒和游離藥物分離的離心條件［10］。結果，包封率隨離心轉速的增大和離心時間的延長而提高，離心后，上清液依然可見藍色乳光，說明在該條件下無法完全分離游離藥物和納米粒，可能需要更高轉速來將其完全分離。

3.2.2 葡聚糖凝膠柱色譜法［11］取溶脹過夜的Sephadex G-50裝柱（1.5 cm×15 cm），精密量取和厚樸酚PLGA納米粒0.5 mL上樣，30%乙醇洗脫，體積流量為0.5 m L/m in，收集洗脫液，每1 m L為一管。然后，分別精密吸取每管洗脫液0.5 mL，置于5 mL量瓶中，乙腈溶解并稀釋至刻度，過濾后進樣測定，繪制洗脫曲線見圖4。由圖可知，洗脫曲線只有一個峰，故該方法無法將納米粒和游離藥物分離開，推測可能是采用含乙醇的流動相洗脫，致使Sephadex G-50已溶脹的粒子表面失水，改變了填料性質［12］，但若采用純水作洗脫液，又可能導致難溶的和厚樸酚結晶析出。

3.2.3 透析法 透析法是一種對儀器設備要求極其簡單的方法。將納米粒注入一定截留分子量的透析袋內，再將其置于合適的透析介質中，根據游離藥物可透過半透膜但納米粒不能透過的原理而達到分離效果。由于該方法簡單準確，而且所需材料價廉易得［13-14］，故綜合考慮，選用透析法測定和厚樸酚PLGA納米粒的包封率。

圖4 和厚樸酚PLGA納米粒葡聚糖G-50洗脫曲線

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R944

B

1001-1528（2015）11-2547-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.050

2014-06-11

廣東省科技廳重大項目 （2011A080504003）

王國強（1988—），男，碩士，從事藥物制劑新技術與新劑型的研究。E-mail：wanggq_88@126.com

*通信作者：呂竹芬 （1965—），女，教授，從事藥物制劑新技術與新劑型的研究。Tel：（020）39352506，E-mail：luzhufen@163.com

日期：2014-09-25

網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/31.1368.R.20140925.1317.001.html