DSS誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304凋亡及機(jī)制研究

張宸豪，陳 為，王月華，李 強(qiáng)，李 妍

（吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林 吉林 132013）

DSS誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304凋亡及機(jī)制研究

張宸豪，陳 為，王月華，李 強(qiáng)，李 妍

（吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林 吉林 132013）

為了研究葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304增殖和凋亡的影響。體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304，采用不同濃度DSS誘導(dǎo)細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡、活性氧（ROS）、線粒體膜電位（MMP）、細(xì)胞周期；WST-1法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率。結(jié)果顯示，隨著DSS濃度的增加細(xì)胞凋亡率增加，并導(dǎo)致細(xì)胞GOG1期阻滯，細(xì)胞內(nèi)活性氧含量減少，同時(shí)線粒體膜電位下降，細(xì)胞增殖抑制率明顯升高。結(jié)果表明，DSS可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

DSS；凋亡；血管內(nèi)皮細(xì)胞

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一組病因不明的慢性腸道炎癥性疾病[1]。在人類表現(xiàn)為兩種獨(dú)立的疾病，潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩病（Crohn's disease，CD），雖然IBD發(fā)病機(jī)制還尚不明確，但環(huán)境因素、遺傳因素、腸道菌群失調(diào)和機(jī)體免疫功能失調(diào)在IBD發(fā)病機(jī)制中占有重要地位[2]。葡聚糖硫酸鈉（Dextran Sulfate Sodium，DSS）是一種人工合成的硫酸多糖體，具有和肝素同樣的抗止血及抗凝血作用，其誘導(dǎo)的小鼠腸道損傷是人類炎性腸病的最常用的實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型[3]，近年來(lái)有學(xué)者認(rèn)為，腸道黏膜血管內(nèi)皮損傷和局部免疫細(xì)胞活化在IBD進(jìn)程中具有重要作用[4]，但尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道DSS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞是否有損傷作用，以及損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制也未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究以體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304為模型，用不同濃度的DSS處理細(xì)胞，分析細(xì)胞增殖、凋亡、活性氧和線粒體膜電位變化。進(jìn)一步揭示其損傷機(jī)制，這對(duì)研究IBD發(fā)生機(jī)制及藥物篩選均有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 人ECV304血管內(nèi)皮細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所；1640培養(yǎng)液，購(gòu)自Gibco公司；小牛血清，購(gòu)自Hyclone公司；PI和Annexin-V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒，購(gòu)自eBiocience公司。JC-1線粒體膜電位（mitochondrialmembrane potential，MMP）檢測(cè)試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)C2006）和ROS熒光探針雙氯熒光黃乙酸乙酯（Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA），購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；DSS，購(gòu)自Sigma公司。流式細(xì)胞儀型號(hào)為Epics XL（美國(guó)貝克曼公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 試驗(yàn)前1周，自液氮中取出凍存的細(xì)胞，復(fù)蘇后在如下條件下培養(yǎng)：含10%小

牛血清1640培養(yǎng)液、5%CO2、飽和濕度和37℃。2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于試驗(yàn)。按如下分組加入DSS制劑：DSS0，200，400，800，1 600 μg/mL和3 200μg/mL誘導(dǎo)細(xì)胞24 h進(jìn)行ROS和凋亡檢測(cè)，或采用DSS 0，200，800μg/mL和3200μg/ mL作用24 h，收集細(xì)胞進(jìn)行線粒體膜電位和細(xì)胞周期分析，DSS 0，200，800μg/mL和3 200μg/mL作用72 h，收集細(xì)胞進(jìn)行增殖試驗(yàn)。

1.3 ROS檢測(cè) 取5×105個(gè)細(xì)胞，PBS洗滌2次，100μL PBS重懸細(xì)胞，加入DCFH-DA儲(chǔ)存液，至其終濃度為5μmol/L，混勻后在37℃避光反應(yīng)30min，PBS洗2次后流式細(xì)胞儀分析。

1.4 細(xì)胞凋亡分析 取5×105個(gè)細(xì)胞，用PBS洗滌2次，取195μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5μL FITC-標(biāo)記Annexin-V，室溫下避光反應(yīng)30min；結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞2次，400μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入PI溶液5μL，5min后用流式細(xì)胞儀分析。

1.5 線粒體膜電位分析 取5×105個(gè)細(xì)胞，參考試劑盒說(shuō)明書提供的方法，配制JC-1染色工作液和染色緩沖液（冰沐保存）。500μL JC-1染色工作液重懸細(xì)胞，37℃避光反應(yīng)30min；離心后棄上清，染色緩沖液洗滌細(xì)胞2次；500μL染色緩沖液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀FL1通道（525 nm）檢測(cè)細(xì)胞所發(fā)射的熒光。

1.6 細(xì)胞周期分析 預(yù)冷PBS洗細(xì)胞兩次，之后用80%預(yù)冷乙醇固定細(xì)胞，-20℃保存過(guò)夜，上機(jī)檢測(cè)前調(diào)細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL，取100μL細(xì)胞懸液加入400μL含有0.01 g/LPI，20×106mol/L的RNase A和0.02%Triton-X100的PBS，室溫閉光處理30min后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，并采用SubG1法分析凋亡細(xì)胞百分率。

1.7 細(xì)胞增殖分析 接種細(xì)胞于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加DSS至不同濃度（0，200，800μg/mL和3 200μg/ mL），每個(gè)處理因素設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)72 h，每孔加入WST-1溶液10μL，37℃培養(yǎng)2 h后，用酶聯(lián)檢測(cè)儀分析450 nm的吸光度值。用3次獨(dú)立試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，計(jì)算不同濃度DSS對(duì)ECV304細(xì)胞增殖的抑制率（IR）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以3次試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示最終結(jié)果。組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，用SPSS15.0軟件做統(tǒng)計(jì)分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 用DSS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS的影響 0，200， 400，800，1 600μg/mL和3 200μg/mLDSS處理細(xì)胞24 h，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞內(nèi)活性氧（圖1），結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)ROS隨濃度增加而降低（表1）。

圖1 DSS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS的影響

表1 DSS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS的影響

2.2 DSS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響 PI和FITC-Annexin-V雙染法分析細(xì)胞凋亡，圖中左下，左上，右上和右下象限分別代表活細(xì)胞，壞死細(xì)胞，晚期凋亡和早期凋亡細(xì)胞（圖2）；凋亡細(xì)胞（含早期凋亡和晚期凋亡）百分率隨濃度增加而增加（表1）。

圖2 DSS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

2.3 DSS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位的影響

JC-1是一種新型熒光探針，進(jìn)入細(xì)胞后，其存在狀態(tài)和發(fā)射熒光與線粒體功能緊密聯(lián)系。線粒體功能正常時(shí)，JC-1主要聚集在線粒體基質(zhì)，形成聚合物，發(fā)射紅色熒光；而在MMP較低時(shí)，JC-1主要以單體形式存在，發(fā)射綠色熒光（圖3）；與對(duì)照組比較，JC-1單體的綠色熒光逐漸增加（圖3），即DSS以濃度依賴的方式導(dǎo)致MMP下降。

圖3 DSS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體膜電位的影響

2.4 DSS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞周期增殖的影響 PI染色和流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期，與對(duì)照組比較，200，800μg/mL和3 200μg/mL的DSS導(dǎo)致G2/M期細(xì)胞減少，G0G1期細(xì)胞增加；凋亡細(xì)胞（SubG1期細(xì)胞）出現(xiàn)（圖4）。

圖4 DSS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞周期的影響

2.5 DSS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響 DSS處理細(xì)胞72 h，200，800μg/mL和3 200μg/mL DSS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用隨著濃度的增加而增加（見(jiàn)圖5）。

圖5 DSS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用

3 討論

癌癥是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一，而約1/ 4癌癥病例的病因和發(fā)病機(jī)制與感染和慢性炎癥相關(guān)[5]。炎癥性腸病（IBD）是一類病因和發(fā)病機(jī)制未明的腸道炎癥性疾病，其發(fā)病率且呈逐年上升和年輕化趨勢(shì)；IBD患者發(fā)生結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）的風(fēng)險(xiǎn)率增高[5-6]。葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）誘發(fā)的結(jié)腸炎相關(guān)性癌癥（colitis associated cancer，CAC）動(dòng)物模型由于成功地模擬IBD誘發(fā)CRC的全過(guò)程，被廣泛用于研究IBD相關(guān)性CRC的癌變機(jī)理，闡明其病理變化與癌變?cè)碛兄诎l(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌治療新的候選靶點(diǎn)。

化學(xué)致炎劑DSS是一種人工合成的硫酸鹽多糖，小鼠經(jīng)飼喂含有DSS的飲水可以形成炎癥性腸病模型（DSS模型）。其病理改變接近人類UC，往往出現(xiàn)以血便、腸道黏膜潰瘍和粒細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的結(jié)腸炎癥。DSS的致炎機(jī)制尚未闡明，可能與DSS攜帶的負(fù)電荷影響DNA合成、抑制上皮細(xì)胞增生、破壞腸黏膜屏障、導(dǎo)致巨噬細(xì)胞功能障礙及腸道菌群失調(diào)有關(guān)[7-9]。近期研究表明，腸道局部血管內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞在IBD進(jìn)程中具有重要作用，但尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道DSS對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞是否有損傷作用，以及影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制也未見(jiàn)報(bào)道。為此本研究以體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞為模型，用不同濃度的DSS處理細(xì)胞，分析細(xì)胞增殖、凋亡、活性氧和線粒體膜電位。研究發(fā)現(xiàn)，DSS可顯著誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、抑制其增殖，并導(dǎo)致細(xì)胞GOG1期阻滯，具有劑量依賴性。DSS對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生有抑制作用，抑制效應(yīng)隨DSS濃度增大而增大。雖然高濃度的ROS本身是過(guò)氧化導(dǎo)致細(xì)胞損傷的重要因素，但ROS也是細(xì)胞正常生長(zhǎng)期線粒體功能的重要產(chǎn)物，一定濃度的ROS是細(xì)胞內(nèi)源的“生長(zhǎng)因子”。本研究發(fā)現(xiàn)，DSS抑制ROS的同時(shí)，細(xì)胞線粒體膜電位也顯著下降，線粒體膜功能受損，凋亡細(xì)胞增加，所以DSS可以通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生和增殖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

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Study on theM echanism of ECV304 Apoptosis Induced by DSS

ZHANGChen-hao，CHENWei，WANG Yue-hua，LIQiang，LIYan
（DepartmentofMedical laboratory，Jilin MedicalCollege，Jilin 132013，China）

The objective of this studywas to investigate the influence of DSSon proliferation and apoptosis in endothelial cells（ECV304）.Different concentrations of DSSwere used to treat ECV304 cells in vitro.Apoptosis，reactive oxygen species（ROS），mitochondrial transmembrane potential（MMP）and cell cycle were analyzed by flow cytometry（FCM），and cellular proliferation in?hibition rate wasmeasured by WST-1.The results showed thatwith the rising concentration of DSS，apoptosis rate and the percent?ageof cellsofG0G1 increased,intracellular reactiveoxygen contentandmitochondrialmembrane potentialdecreased,and the prolif?eration inhibition rate was significantly increased.DSS can inhibit proliferation of ECV304 and induce apoptosis.

DSS；apoptosis；EndothelialCells

LIYan

R 363

A

0529-6005（2015）11-0039-03

2015-07-07

吉林省科技廳中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才及團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（20130521018JH）；吉林省教育廳十二五"科學(xué)技術(shù)研究（吉科教合字[2012]第487號(hào)）；吉林省衛(wèi)生廳項(xiàng)目（2013Z09-1）；吉林市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201133101）

張宸豪（1972-），男，副教授，博士，從事抗感染免疫的機(jī)制研究，E-mail：zhangchenhao0618@163.com

李妍，E-mail：liyan@jlmpc.cn