食品中金黃色葡萄球菌檢測方法的分類與進展

韋宏珍

廣西武鳴縣疾病預防控制中心　530199

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食品中金黃色葡萄球菌檢測方法的分類與進展

韋宏珍

廣西武鳴縣疾病預防控制中心530199

摘要金黃色葡萄球菌是人類一種重要的病原菌，是革蘭氏陽性菌的代表，可引起人類食物中毒和許多嚴重感染，因此對于金黃色葡萄球菌的檢測有重要意義，本文對其檢測方法進行了分析，并對其研究的現(xiàn)代進展進行論述。

關鍵詞金黃色葡萄球菌檢測方法進展

金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus,S.aureus)是一種常見的病原微生物，它廣泛分布在自然界，包括空氣、水以及動物的排泄物中。S.aureus能分泌20多種毒性蛋白質，產生腸毒素、殺白細胞素等多種毒素以及多種酶類，容易引起人和動物化膿感染、人食物中毒。S.aureus會通過食品的加工、包裝及運輸過程污染食品，其分泌的毒素對熱的抵抗力很強，加熱煮沸30min仍能致病。在美國，由S.aureus引起的食物中毒占全部細菌性食物中毒的33%，加拿大更是占到了45%[1]，而在我國則有25%[2]。因此，S.aureus為我國食品安全國家標準食品微生物檢驗常規(guī)檢測項目之一[3]。為加強食品中S.aureus的檢測及食物中毒的預防和控制，本文對目前S.aureus檢測方法的研究進展進行綜述，旨在為從事S.aureus檢驗的工作人員提供科學的依據(jù)和指導。

1S.aureus傳統(tǒng)檢驗法

食品中S.aureus的檢驗方法[3]：無菌取樣25g(ml)，加入225ml 7.5%NaCl肉湯或胰蛋白胨肉湯中均質，制成10-1稀釋液，將10-1稀釋液(36±1)℃培養(yǎng)18～24h;將上述稀釋液或培養(yǎng)液分別劃線Baird-Parker平板和血平板，(36±1)℃分別培養(yǎng)18～48h、18～24h，挑取Baird-Parker平板上圓形顏色呈灰至黑色、周圍有一渾濁帶、外層有一透明圈和血平板上金黃色或白色、周圍有溶血圈的菌落進行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。

2S.aureus快速檢測法

2.1紙片法快速測試片是較常用的一種方法，用紙片、膠片、膜等作為培養(yǎng)基載體，添加特定的培養(yǎng)基和顯色物質，通過觀察微生物的生長、顯色來測定食品中的微生物[4,5]。紙片測試的方法操作簡單方便，便于運輸攜帶方便，其缺點是耗時長、無法準確定性和計數(shù)。

2.2S.aureus顯色培養(yǎng)基是一類利用微生物自身代謝產生的酶與相應顯色底物反應而顯色的新型培養(yǎng)基。通過將目標微生物特征性酶的顯色底物加入到選擇性培養(yǎng)基中，當目標微生物生長時，其特征性酶表達進而與底物反應并形成有顏色的代謝物，而干擾菌的生長受到抑制或不產生相應的酶，與底物不反應而不顯色，因而根據(jù)菌落顏色進行辨別。該方法具有靈敏性、特異性和選擇性。根據(jù)菌落顏色就可鑒定菌種，不需要補充試驗[6~8]。目前常用于S.aureus顯色培養(yǎng)基主要有培養(yǎng)基A、培養(yǎng)基B和PEN-TCF，其中A和PEN-TCF的回收率較高，而B抗干擾能力稍強[9]。

3免疫學方法

免疫學檢測S.aureus的方法主要有:(1)乳膠凝集試驗，通過使用含單克隆抗體的乳膠凝集試驗可以簡單、快捷鑒定S.aureus。新開發(fā)的Slidex staph.plus乳膠試劑，對于S.aureus的檢測靈敏度較高，尤其對耐甲氧西林和甲氧西林敏感的S.aureus，檢測僅需數(shù)分鐘，是一種簡便快速度的檢測方法。(2)血漿凝固酶試驗，S.aureus可以產生血漿凝固酶，將血漿中纖維蛋白變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白，生成凝塊。血漿凝固酶試驗可以判定菌株是否具有致病力，常用于鑒定S.aureus和其他葡萄球菌。

4分子生物學方法

4.1PCR法作為主要的分子生物學方法，1985年由Mullis等創(chuàng)立，不同于傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測方法，PCR法對活菌和受損菌以及死菌均可檢測，是一種以變性、退火、延伸為基本步驟的體外外快速擴增特異目標基因的技術，也被稱為基因的體外擴增法[10]。此方法具有迅速準確的優(yōu)點，但儀器設備較昂貴，技術要求較高，對實驗室條件要求較高，不適用于一般實驗室。同時，普通PCR產物還會引起污染，增加假陽性結果，反應中添加的溴化乙錠具有較強的致癌性，會引起健康問題。

4.2熒光定量PCR法1996年，美國Applied Biosystems公司推出的新定量試驗技術，使用熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應過程，結合軟件可對產物進行定量分析的方法。謝曉紅等對于熒光定量法對食源性疾病的研究[11]，發(fā)現(xiàn)其靈敏度達4~8CFU/ml，是普通PCR靈敏度的10倍、常規(guī)培養(yǎng)的1 000倍，本方法具有操作簡單快速、高特異和高靈敏的特點。

4.3環(huán)介導恒溫擴增法其廣泛應用于生命科學領域，主要包括病毒、細菌和真菌等檢測[12~18]。根據(jù)靶目標序列上的特異區(qū)域設計引物，在恒溫條件下，利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶，通過形成環(huán)狀結構及鏈置換，對目標DNA進行大量擴增并形成多種片段DNA產物的一種新型核酸擴增方法。該方法具有高效、特異、快速等特點。

5腸毒素檢測

S.aureus病原性是由攜帶的腸毒素引起的。金黃色葡萄球菌其耐熱性較差，在常規(guī)加熱的情況下即可殺滅病菌，而腸毒素的耐熱性較強。因此，國際上食品檢驗的法規(guī)中將腸毒素的檢測納入。根據(jù)檢測原理分為三種：動物實驗法、免疫血清學方法，核酶擴增法。

5.1動物實驗法以幼貓為研究對象，在食物中毒患者的剩余食物、嘔吐物或者糞便做細菌分離鑒定的同時，將其接種在肉湯培養(yǎng)基中，在6~8周齡的幼貓腹腔中注射孵育后取出的濾液，在注射4h后，出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、體溫升高或者死亡的情況，提示存在腸毒素的可能。其優(yōu)點是觀察結果準確、判定直觀，缺點是動物的來源困難及靈敏度較差。

5.2免疫血清學方法在食品衛(wèi)生檢驗中S.aureus腸毒素免疫血清學方法是一種以腸毒素為抗原，生產相應特異性抗體，通過結合性反應發(fā)生，形成可見沉淀為原理的檢測方法。包括免疫瓊脂擴散法、反向間接血凝試驗法、反向被動乳膠凝集試驗法、酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫測定法、酶聯(lián)免疫化學發(fā)光檢測法等。酶聯(lián)免疫吸附法是利用酶標記的抗原或抗體在固相載體上進行抗原或抗體的測定，具有高靈敏度、操作簡便、反應迅速、無特殊設備的優(yōu)點，目前已有商品化的試劑盒，其缺點是易引起交叉反應造成假陽性。

5.3核酶擴增法針對細菌的核酸而發(fā)展起來的基因分型檢測方法，包括常規(guī)PCR法、熒光定量PCR法和LAMP技術。PCR法可診斷基因水平并大量樣品進行檢測，可直接應用于檢測S.aureus的產毒基因。張嚴峻等[19]運用PCR方法檢測從患者中分離的80株S.aureus，得到9株基因型，腸毒素攜帶率為85.0%，具有2種以上毒素基因的菌株占76.3%；食品中分離得到51株S.aureus，檢測到7種基因型，腸毒素攜帶率為68.7%，具有2種以上毒素基因的菌株占21.6%。與傳統(tǒng)培養(yǎng)或免疫學方法相比，PCR技術具有高敏感性、強特異性、高重復性、高自動化程度等特點，可提供快速、準確的病原學診斷，但也受到食品基質、培養(yǎng)基成分的干擾，殘留食物成分也會影響PCR反應，死亡的S.aureus殘留DNA易造成假陽性結果。熒光定量PCR技術在一定程度上克服PCR的不足和缺點，它實行封閉式操作、熒光標記探針具有更高的特異性、高通量與自動化使其操作簡便、節(jié)省時間，且能處理大樣本量篩查；其缺點主要是昂貴的儀器和試劑，對實驗人員的操作能力要求較高，限制了大規(guī)模的應用。

6總結與展望

上述是檢測S.aureus的常用方法。隨著技術不斷提高，常規(guī)細菌培養(yǎng)愈發(fā)成熟，已成為基層最常用的方法，但由于操作復雜、費時，不能做到早期快速診斷。免疫學方法因其靈敏性和特異性較低，目前還不為廣泛接受。分子生物學方法雖然快速、敏感性和特異性高，但高檢測費用也限制其在基層實驗室廣泛應用。將分子生物學技術和免疫學知識有效結合檢測和預防S.aureus引起的食物中毒，并且對食源性疾病的檢測和預防也有一定的幫助，隨著社會的發(fā)展和現(xiàn)代化的迅猛變化，傳統(tǒng)檢測方式的適應性已經下降，對于快速檢測方法的研究已成為現(xiàn)代化的需求，對于分子分型的建立，是未來檢測方法的方向和趨勢。

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中圖分類號：TS201.6

文獻標識碼：A

文章編號：1001-7585(2015)11-1446-03