食品中金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法的分類與進(jìn)展

韋宏珍

廣西武鳴縣疾病預(yù)防控制中心　530199

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食品中金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法的分類與進(jìn)展

韋宏珍

廣西武鳴縣疾病預(yù)防控制中心530199

摘要金黃色葡萄球菌是人類一種重要的病原菌，是革蘭氏陽性菌的代表，可引起人類食物中毒和許多嚴(yán)重感染，因此對(duì)于金黃色葡萄球菌的檢測(cè)有重要意義，本文對(duì)其檢測(cè)方法進(jìn)行了分析，并對(duì)其研究的現(xiàn)代進(jìn)展進(jìn)行論述。

關(guān)鍵詞金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法進(jìn)展

金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus,S.aureus)是一種常見的病原微生物，它廣泛分布在自然界，包括空氣、水以及動(dòng)物的排泄物中。S.aureus能分泌20多種毒性蛋白質(zhì)，產(chǎn)生腸毒素、殺白細(xì)胞素等多種毒素以及多種酶類，容易引起人和動(dòng)物化膿感染、人食物中毒。S.aureus會(huì)通過食品的加工、包裝及運(yùn)輸過程污染食品，其分泌的毒素對(duì)熱的抵抗力很強(qiáng)，加熱煮沸30min仍能致病。在美國，由S.aureus引起的食物中毒占全部細(xì)菌性食物中毒的33%，加拿大更是占到了45%[1]，而在我國則有25%[2]。因此，S.aureus為我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物檢驗(yàn)常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目之一[3]。為加強(qiáng)食品中S.aureus的檢測(cè)及食物中毒的預(yù)防和控制，本文對(duì)目前S.aureus檢測(cè)方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為從事S.aureus檢驗(yàn)的工作人員提供科學(xué)的依據(jù)和指導(dǎo)。

1S.aureus傳統(tǒng)檢驗(yàn)法

食品中S.aureus的檢驗(yàn)方法[3]：無菌取樣25g(ml)，加入225ml 7.5%NaCl肉湯或胰蛋白胨肉湯中均質(zhì)，制成10-1稀釋液，將10-1稀釋液(36±1)℃培養(yǎng)18～24h;將上述稀釋液或培養(yǎng)液分別劃線Baird-Parker平板和血平板，(36±1)℃分別培養(yǎng)18～48h、18～24h，挑取Baird-Parker平板上圓形顏色呈灰至黑色、周圍有一渾濁帶、外層有一透明圈和血平板上金黃色或白色、周圍有溶血圈的菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn)。

2S.aureus快速檢測(cè)法

2.1紙片法快速測(cè)試片是較常用的一種方法，用紙片、膠片、膜等作為培養(yǎng)基載體，添加特定的培養(yǎng)基和顯色物質(zhì)，通過觀察微生物的生長、顯色來測(cè)定食品中的微生物[4,5]。紙片測(cè)試的方法操作簡(jiǎn)單方便，便于運(yùn)輸攜帶方便，其缺點(diǎn)是耗時(shí)長、無法準(zhǔn)確定性和計(jì)數(shù)。

2.2S.aureus顯色培養(yǎng)基是一類利用微生物自身代謝產(chǎn)生的酶與相應(yīng)顯色底物反應(yīng)而顯色的新型培養(yǎng)基。通過將目標(biāo)微生物特征性酶的顯色底物加入到選擇性培養(yǎng)基中，當(dāng)目標(biāo)微生物生長時(shí)，其特征性酶表達(dá)進(jìn)而與底物反應(yīng)并形成有顏色的代謝物，而干擾菌的生長受到抑制或不產(chǎn)生相應(yīng)的酶，與底物不反應(yīng)而不顯色，因而根據(jù)菌落顏色進(jìn)行辨別。該方法具有靈敏性、特異性和選擇性。根據(jù)菌落顏色就可鑒定菌種，不需要補(bǔ)充試驗(yàn)[6~8]。目前常用于S.aureus顯色培養(yǎng)基主要有培養(yǎng)基A、培養(yǎng)基B和PEN-TCF，其中A和PEN-TCF的回收率較高，而B抗干擾能力稍強(qiáng)[9]。

3免疫學(xué)方法

免疫學(xué)檢測(cè)S.aureus的方法主要有:(1)乳膠凝集試驗(yàn)，通過使用含單克隆抗體的乳膠凝集試驗(yàn)可以簡(jiǎn)單、快捷鑒定S.aureus。新開發(fā)的Slidex staph.plus乳膠試劑，對(duì)于S.aureus的檢測(cè)靈敏度較高，尤其對(duì)耐甲氧西林和甲氧西林敏感的S.aureus，檢測(cè)僅需數(shù)分鐘，是一種簡(jiǎn)便快速度的檢測(cè)方法。(2)血漿凝固酶試驗(yàn)，S.aureus可以產(chǎn)生血漿凝固酶，將血漿中纖維蛋白變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白，生成凝塊。血漿凝固酶試驗(yàn)可以判定菌株是否具有致病力，常用于鑒定S.aureus和其他葡萄球菌。

4分子生物學(xué)方法

4.1PCR法作為主要的分子生物學(xué)方法，1985年由Mullis等創(chuàng)立，不同于傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測(cè)方法，PCR法對(duì)活菌和受損菌以及死菌均可檢測(cè)，是一種以變性、退火、延伸為基本步驟的體外外快速擴(kuò)增特異目標(biāo)基因的技術(shù)，也被稱為基因的體外擴(kuò)增法[10]。此方法具有迅速準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，但儀器設(shè)備較昂貴，技術(shù)要求較高，對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求較高，不適用于一般實(shí)驗(yàn)室。同時(shí)，普通PCR產(chǎn)物還會(huì)引起污染，增加假陽性結(jié)果，反應(yīng)中添加的溴化乙錠具有較強(qiáng)的致癌性，會(huì)引起健康問題。

4.2熒光定量PCR法1996年，美國Applied Biosystems公司推出的新定量試驗(yàn)技術(shù)，使用熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合軟件可對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析的方法。謝曉紅等對(duì)于熒光定量法對(duì)食源性疾病的研究[11]，發(fā)現(xiàn)其靈敏度達(dá)4~8CFU/ml，是普通PCR靈敏度的10倍、常規(guī)培養(yǎng)的1 000倍，本方法具有操作簡(jiǎn)單快速、高特異和高靈敏的特點(diǎn)。

4.3環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法其廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域，主要包括病毒、細(xì)菌和真菌等檢測(cè)[12~18]。根據(jù)靶目標(biāo)序列上的特異區(qū)域設(shè)計(jì)引物，在恒溫條件下，利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶，通過形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)及鏈置換，對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行大量擴(kuò)增并形成多種片段DNA產(chǎn)物的一種新型核酸擴(kuò)增方法。該方法具有高效、特異、快速等特點(diǎn)。

5腸毒素檢測(cè)

S.aureus病原性是由攜帶的腸毒素引起的。金黃色葡萄球菌其耐熱性較差，在常規(guī)加熱的情況下即可殺滅病菌，而腸毒素的耐熱性較強(qiáng)。因此，國際上食品檢驗(yàn)的法規(guī)中將腸毒素的檢測(cè)納入。根據(jù)檢測(cè)原理分為三種：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法、免疫血清學(xué)方法，核酶擴(kuò)增法。

5.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)法以幼貓為研究對(duì)象，在食物中毒患者的剩余食物、嘔吐物或者糞便做細(xì)菌分離鑒定的同時(shí)，將其接種在肉湯培養(yǎng)基中，在6~8周齡的幼貓腹腔中注射孵育后取出的濾液，在注射4h后，出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、體溫升高或者死亡的情況，提示存在腸毒素的可能。其優(yōu)點(diǎn)是觀察結(jié)果準(zhǔn)確、判定直觀，缺點(diǎn)是動(dòng)物的來源困難及靈敏度較差。

5.2免疫血清學(xué)方法在食品衛(wèi)生檢驗(yàn)中S.aureus腸毒素免疫血清學(xué)方法是一種以腸毒素為抗原，生產(chǎn)相應(yīng)特異性抗體，通過結(jié)合性反應(yīng)發(fā)生，形成可見沉淀為原理的檢測(cè)方法。包括免疫瓊脂擴(kuò)散法、反向間接血凝試驗(yàn)法、反向被動(dòng)乳膠凝集試驗(yàn)法、酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫測(cè)定法、酶聯(lián)免疫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法等。酶聯(lián)免疫吸附法是利用酶標(biāo)記的抗原或抗體在固相載體上進(jìn)行抗原或抗體的測(cè)定，具有高靈敏度、操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)迅速、無特殊設(shè)備的優(yōu)點(diǎn)，目前已有商品化的試劑盒，其缺點(diǎn)是易引起交叉反應(yīng)造成假陽性。

5.3核酶擴(kuò)增法針對(duì)細(xì)菌的核酸而發(fā)展起來的基因分型檢測(cè)方法，包括常規(guī)PCR法、熒光定量PCR法和LAMP技術(shù)。PCR法可診斷基因水平并大量樣品進(jìn)行檢測(cè)，可直接應(yīng)用于檢測(cè)S.aureus的產(chǎn)毒基因。張嚴(yán)峻等[19]運(yùn)用PCR方法檢測(cè)從患者中分離的80株S.aureus，得到9株基因型，腸毒素?cái)y帶率為85.0%，具有2種以上毒素基因的菌株占76.3%；食品中分離得到51株S.aureus，檢測(cè)到7種基因型，腸毒素?cái)y帶率為68.7%，具有2種以上毒素基因的菌株占21.6%。與傳統(tǒng)培養(yǎng)或免疫學(xué)方法相比，PCR技術(shù)具有高敏感性、強(qiáng)特異性、高重復(fù)性、高自動(dòng)化程度等特點(diǎn)，可提供快速、準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷，但也受到食品基質(zhì)、培養(yǎng)基成分的干擾，殘留食物成分也會(huì)影響PCR反應(yīng)，死亡的S.aureus殘留DNA易造成假陽性結(jié)果。熒光定量PCR技術(shù)在一定程度上克服PCR的不足和缺點(diǎn)，它實(shí)行封閉式操作、熒光標(biāo)記探針具有更高的特異性、高通量與自動(dòng)化使其操作簡(jiǎn)便、節(jié)省時(shí)間，且能處理大樣本量篩查；其缺點(diǎn)主要是昂貴的儀器和試劑，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的操作能力要求較高，限制了大規(guī)模的應(yīng)用。

6總結(jié)與展望

上述是檢測(cè)S.aureus的常用方法。隨著技術(shù)不斷提高，常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)愈發(fā)成熟，已成為基層最常用的方法，但由于操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，不能做到早期快速診斷。免疫學(xué)方法因其靈敏性和特異性較低，目前還不為廣泛接受。分子生物學(xué)方法雖然快速、敏感性和特異性高，但高檢測(cè)費(fèi)用也限制其在基層實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。將分子生物學(xué)技術(shù)和免疫學(xué)知識(shí)有效結(jié)合檢測(cè)和預(yù)防S.aureus引起的食物中毒，并且對(duì)食源性疾病的檢測(cè)和預(yù)防也有一定的幫助，隨著社會(huì)的發(fā)展和現(xiàn)代化的迅猛變化，傳統(tǒng)檢測(cè)方式的適應(yīng)性已經(jīng)下降，對(duì)于快速檢測(cè)方法的研究已成為現(xiàn)代化的需求，對(duì)于分子分型的建立，是未來檢測(cè)方法的方向和趨勢(shì)。

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中圖分類號(hào)：TS201.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-7585(2015)11-1446-03