腦缺血再灌注損傷治療的實驗研究進展

王富明 徐 虹 孫 華

腦卒中是最常見的一種疾病。根據2013 年《中國衛生和計劃生育統計年鑒》，腦血管疾病可能引起高病死率和致殘率，已經位居中國城市居民死亡原因的第3 位，對人類的健康造成了嚴重威脅。大約80% ～85%的腦卒中患者屬于缺血性腦卒中［1］。因此探索腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)的機制和找到有效的治療手段是目前的研究重點。組織纖溶酶原激活物TPA 是目前唯一的FDA 批準的治療腦缺血的藥物，主要作用于堵塞的血管再通并使之再灌注，但因其適應證、禁忌證的限制，導致臨床上多數患者無法使用該藥物。而且CIRI 后的細胞損傷主要由于再灌注引起的，并且隨之而來的細胞色素C 的釋放、caspase -3 的激活、DNA 的破碎最終導致了細胞的凋亡。因此，TPA 的治療時間窗、禁忌證以及再灌注引起的細胞損傷使其在臨床的應用受限。因此本文從CIRI 發生的機制入手，探討可能的治療手段。

一、抗氧化劑

腦是機體代謝率最高的器官，且大部分是通過有氧代謝得到能量。正常情況下，活性氧和抗氧化系統之間處于平衡狀態。在某種情況下，機體的氧化-抗氧化系統失衡時，機體產生過多的氧化應激產物即活性氧，也被稱為氧自由基。自由基是一類包含一個或多個與分子的內部未配對電子的分子。這些自由基與其他分子如DNA 和脂質反應十分活躍，通過與單個電子配對而引起上述物質的氧化。當氧氣獲得一個額外的電子后，就會形成超氧陰離子，使分子多一個未配對的電子。CIRI 后會產生多種氧自由基及其派生物，主要包括以下兩類:(1)屬于氧自由基系列，包括超氧陰離子(O-2)，羥基自由基(OH-)等。其主要產生于線粒體中，約2% ～5%的電子流是由其形成的。(2)脂質自由基系列，包括烷自由基、烷氧自由基以及脂質過氧化物自由基等。腦缺血再灌注損傷后，機體活性氧系統和抗氧化系統之間的平衡被打破時會對神經系統產生較為嚴重的損害作用。在腦缺血早期，腦血管局部血液灌注明顯減少，導致缺氧并產生腦損傷。隨后的再灌注過程，酶和線粒體將氧作為底物產生大量的氧自由基。多基因脂肪酸脂質過氧化過程中過氧化分解的終末產物如丙二醛(malondiadehyde，MDA)對很多細胞結構，如脂質成分、細胞膜、蛋白成分以及DNA 等產生損傷。

1.天然抗氧化物質:人體存在許多直接的抗氧化物質如自由基代謝酶，包括超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶等，抗氧化劑包括維生素E、維生素C 等。細胞本身也能合成一部分抗氧化劑，如谷胱甘肽等。除了直接作用的抗氧化物質，還包括間接作用的抗氧化劑如金屬絡合劑，將體內不斷生成的自由基清除，維持機體的動態平衡。天然植物中也存在有很多具有抗氧化作用的成分。有人從銀杏中提取出一種阿拉伯類型多糖(GBPw)，從多種食物中提出多酚類成分，苦豆子提取物氧化槐定堿等均證明天然植物提取物對腦缺血動物具有抗氧化作用［2～4］。

2.人工合成抗氧化劑:依達拉奉是目前臨床上應用較廣的腦缺血后靜脈用藥，也是一種氧自由基清除劑，有報道指出，其可以通過干擾脂質氧化，改善線粒體水腫，提高內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表達，增加腦血流量，減少自由基形成，降低腦梗死面積，防止神經元遲發性損傷［5］。不僅如此，其還有抗凋亡、抗細胞壞死、抗炎作用。臨床報道也指出應用該藥物治療腦梗死患者，可以改善腦缺血患者的腦水腫以及預后。因此在日本和中國其應用較為廣泛。除此之外，另一種抗氧化的研究也較多。在中樞神經系統，氧自由基可以由很多分子以及結構產生，比如線粒體、黃嘌呤氧化酶、非偶合一氧化氮合酶以及環氧酶等。然而，只有NAPDH 氧化酶是專一的產生ROS 的酶類。與腦缺血有關的NAPDH 氧化酶尤其是第4 類磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶［type 4 nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH)oxidase，NOX4］，其表達主要分布在神經元［6］。NOX4 敲除的小鼠的腦梗死體積明顯減少(75%)，其作用與應用NOX 抑制劑的小鼠相似［7］。因此抑制NOX4 的藥物可能為缺血再灌注損傷腦組織提供保護作用。有報道稱，酪蛋白激酶2(CK2)是NADPH 氧化酶的重要調節劑，CK2 在腦組織的失活可以通過增加NADPH 氧化酶(第2 類磷酸酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶，NOX2)的活動，增加ROS 類物質的產生以及神經元的死亡。使用CK2 抑制劑的大鼠腦組織中腦梗死面積明顯增加，并且其作用可以被NADPH 氧化酶抑制劑apocynin 削弱［8］。目前NADPH 氧化酶的研究較多，但是不同的亞基表達的部位不同，有些亞基表達在腦組織，并且各個腦區的分布也不太一樣。根據目前文獻，COX2 是在CIRI 中最為重要的一種。因此COX2 抑制劑有望成為特異性的治療腦缺血的抗氧化藥物。

二、細胞凋亡抑制劑

凋亡被認為是一種程序性死亡，根據目前的研究，主要有3 種引起細胞凋亡的通路:線粒體通路、內質網通路和死亡受體通路。其中對線粒體通路的研究最為深入和透徹。線粒體是ROS 產生的主要場所，在正常的情況下，它們對機體起防御作用，腦缺血時線粒體易成為ROS 攻擊的靶點，導致自由基攻擊磷脂膜以及膜電位的變化，干擾其產生ATP 的氧化磷酸化過程。另外，谷氨酸興奮性中毒、缺血后低氧、Ca2+超載等均會刺激缺血后受損的線粒體ROS 的產生。存在于線粒體內膜上的呼吸鏈是內源性ROS 的主要來源。目前大多數研究者認為半胱氨酸蛋白酶caspase 家族參與了線粒體相關凋亡的過程。與腦缺血有關的caspase 家族成員有caspase -3、caspase -8、caspase-9、caspase -12 等。另外一個線粒體相關凋亡蛋白家族包括促凋亡蛋白(Bad、Bax、Bim)以及抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl -xl、Bcl -w)。它們通常被認為是通過線粒體內膜的通透性調節細胞凋亡。B淋巴細胞瘤-2 基因(B -cell lymphoma -2，Bcl -2)是細胞凋亡研究中最受重視的癌基因之一。凋亡誘導因子(apoptosis -inducing factor，AIF)也是線粒體相關蛋白，可以通過細胞核和細胞質兩條通路激活凋亡信號［9］。線粒體通路是目前研究較多，也較為透徹的信號路徑，也是目前研究的熱點。

caspase 抑制劑可能會對凋亡有抑制作用，從而減緩CIRI 損傷。有研究者在大鼠腦缺血-再灌注實驗中，證明高壓氧預適應能減輕腦損傷和細胞凋亡率，提高細胞色素C(Cyc -C)水平和降低caspase 酶類活性，說明了高壓氧預適應對腦缺血-再灌注的保護作用可能與抑制線粒體凋亡通路有關［10］。在目前的動物實驗中，凋亡抑制劑途徑被認為是值得研究的針對CIRI 的有效方法。有研究者對大鼠進行腹腔caspase-3 抑制劑Z - Asp - Val - Fluoromethyl Ketone(Z-DEVD-FMK)注射，治療4 天和14 天后觀察動物一般生命體征，神經功能評分，腦缺血區域體積，缺血皮質caspase -3 表達以及細胞凋亡的情況。證明caspase -3 抑制劑可以明顯改善動物的神經功能評分、梗死體積以及細胞凋亡。根據目前的研究結果，大多數文獻支持，海馬區CA1、CA2 是CIRI 后容易產生損傷的腦區。就發生時間來說，相對于海馬的(48 ～96h)，紋狀體在CIRI 后的損傷往往要比海馬提前(數小時內)。實際上，很多影響因素包括實驗動物、損傷的模型、再灌注的時間等都會影響實驗的結果。因此今后的研究需要根據不同的實驗目的，選取不同的動物模型，不同損傷區域進行研究。

三、炎癥抑制劑

腦缺血后的氧和葡萄糖供應不足，導致了腦缺血區域神經元和炎癥細胞的損傷以及代謝產物的集聚。受損的神經元和炎性細胞通過釋放炎性因子，如腫瘤細胞因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin -1β，IL -1β)、白細胞介素-6(interleukin -6，IL -6)等，進一步促進黏附分子的表達和炎性因子的募集。最終導致缺血區域血管內皮的滲出和血腦脊液屏障結構的破壞。因此這些炎性因子的抑制劑被認為可以減少腦組織的梗死面積。在眾多的炎癥相關分子中，NF -κB 是一個重要的調節分子，主要在神經元、星形膠質細胞、小膠質細胞以及炎性細胞中表達。多種NF -κB 抑制劑被認為可以減少炎性因子的表達，從而減少CIRI 后腦組織的損傷［11，12］。另外，Toll 樣受體(TLRs)是一種表達在如B 細胞、樹突狀細胞、小膠質細胞以及血管內皮細胞、星形膠質細胞很多免疫細胞等和神經元等細胞的一種跨膜蛋白。根據其不同作用，大致可以分為4 型。TLRs 的激活被認為和炎癥密切相關。TLR2 和TLR4 因其在CIRI 中的重要作用而備受關注，兩者可以分泌大量的炎性細胞因子，如IL-23、IL-17、TNF-α 和COX -2 等［13］。因此TLRs 的抑制劑被認為有抗炎作用。但是鑒于炎癥在CIRI 中的作用機制較為復雜，尤其是其瀑布級聯反應，不是單一的控制某一個反應，或者抑制某一個分子就可以達到控制神經炎癥的目的。因此找到有效的控制神經炎癥的方法還需要進一步探索和嘗試。

四、細胞內外信號通路調節藥物

目前研究發現，有很多細胞內外信號調解通路參與了CIRI 的過程。其中之一是ERK 途徑，它是細胞外信號調節激酶1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2，EPK1/2)，也是絲裂原活化蛋白激酶家族的(mitogen - activated proteinkinase，MAPK)一種。激活的MAPKs 通過磷酸化多種轉錄因子、細胞骨架相關蛋白和其他酶類等多種蛋白底物來調節多種細胞生理過程，參與細胞死亡等生理過程，它也被稱為細胞外信號引起細胞核反應的共同通路。腦缺血后，細胞的缺血缺氧通過三級級聯反應激活ERK 通路，導致其表達升高。和腦缺血相關的細胞通路抑制劑包括JNK(c -Jun N -terminal kinase)抑制劑、SphK(sphingosine kinase)抑制劑等［14～16］。這些蛋白激酶的抑制劑可以改善CIRI 后腦梗死體積，減輕腦水腫發生，改善神經功能評分。其作用機制或與血腦屏障的修復有關，或與內皮細胞離子通道的開放以及水通道蛋白的表達有關。還有研究表明其作用機制與細胞的凋亡和抑制炎性反應相關，或者是兩個或者多個機制共同作用的結果。總之，其具體的機制目前研究不是特別明確，因此其臨床應用尚需進一步驗證。

五、中藥、針刺的抗氧化作用

中醫中藥在治療腦缺血再灌注損傷中起到重要作用。中藥單方、復方制劑以及針刺療法等可能通過抗氧自由基，降低MDA 含量，提高SOD 等抗氧化作用產物含量以及自由基反應酶的活性，抑制細胞膜脂質過氧化和自由基的反應性損傷。有研究者探討黃芪-紅花的復合物有效成分黃芪甲苷以及羥基紅花黃色素A 對腦缺血的作用。證明其可以增加抗氧化劑如SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)含量，同時降低MDA 含量，從而減少ROS 的產生［17］。另外體外實驗證明，中藥黃芪的提取物黃芪皂甙可以提高缺血缺氧細胞的細胞活性，減少乳酸脫氫酶，氧化應激產物含量，同時減輕細胞凋亡，細胞自噬，線粒體功能的損傷以及內質網應激反應［18］。史慧妍等［19］用醒腦開竅針刺法探討其對腦缺血大鼠皮質抗氧化蛋白Ⅳ(peroxiredoxin Ⅳ)的表達以及干預作用，結果提示醒腦開竅針刺法與傳統針刺手法相比，能夠提高大鼠腦缺血后皮質抗氧化蛋白Ⅳ的表達，提高大鼠腦缺血后的抗氧化能力。雖然中醫藥保護CIRI 取得了一定成就，但是存在中藥成分復雜，中藥單復方制劑相對較少，辨證論治困難等難題。針灸領域存在針刺手法、取穴、電針參數差異以及針刺對照的選擇等問題。

六、其 他

目前針對DNA 損傷，端粒酶是可能的治療靶點，它是由染色體末端的一系列非編碼的重復序列構成，可以防止在細胞分裂過程中編碼序列的丟失。體內和體外實驗都表明，端粒酶的一個催化亞基端粒酶反轉錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)可能通過相關機制抑制內源性以及外源性的凋亡通路，減少caspase-3 表達和神經元的凋亡，調整Bcl-2/Bax 比例和線粒體膜動作電位，從而保護受損的神經元［20，21］。雖然端粒酶在腦缺血中可能發揮抗凋亡、減少興奮性氨基酸的釋放、促進神經血管和神經再生等作用，但其作用機制不明確，因此進一步研究有助于通過端粒酶途徑改善CIRI。最近的實驗結果顯示小干擾RNA (siRNAs)和非編碼RNA 被認為也具有治療腦缺血的作用，如caspase -3 的siRNAs 被認為可以減少細胞凋亡，人為沉默一些炎性表達基因也可以減少CIRI 后動物的腦梗死體積［22］。另外，干細胞治療也在該領域做了一些有益的嘗試［23］。

七、展 望

總體來說，針對腦缺血再灌注損傷治療的藥物的研究取得了一定進展。通過抗氧化劑、細胞凋亡抑制劑、炎性抑制劑、干擾細胞信號調節的藥物以及中藥、針灸等，可以緩解腦缺血再灌注損傷。隨著一些先進的實驗技術的使用，CIRI 的治療手段也越來越豐富。但是，鑒于缺血性腦血管疾病十分復雜的發病機制，能夠明顯減少腦梗死患者致殘率、致死率的藥物目前仍在探索中，加強治療腦缺血作用的小干擾RNA 和非編碼RNA 以及干細胞治療等研究工作，尋求一些對腦缺血再灌注損傷治療明顯的藥物，將成為今后主要的研究方向。

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