GKNs 在胃癌中的研究進展

劉 姣 凌 暉

目前發現胃動蛋白家族包括3 個成員，即胃動蛋白-1(GKN1，AMP-18，gastrokine-1)，胃動蛋白-2(GKN2，GDDR，gastrokine-2)，胃動蛋白-3(GKN3，gastrokine-3)。30 年前，在胃激素促胃液素的克隆過程中，一種未知cDNA 被分離出來。這種cDNA 后來被人發現它編碼一種18kDa 的蛋白，AMP -18，在人、鼠和豬當中都有很高的序列同源性，說明其在進化上具有高度的保守性，AMP -18 在胃竇中高表達，但在其他組織中表達減少或無表達。之后，在所觀察到的這種生長因子或“細胞因子樣”活性物質傾向于胃上皮細胞的前提下，經HUGO 基因命名委員會(HGNC)批準，人們將這種以前被稱為AMP18、CA11、BRICD1 和 TFIZ2 的 蛋 白，正 式 命 名 為GKN1［1］。后來杜建軍博士克隆到胃癌下調或缺失的一種新基因，命名為GDDR［2］。GDDR 編碼的蛋白與GKN1 結構相似，并為同源蛋白，所以GDDR 又稱為GKN2。這是GKN 家族的第2 個成員，此外，GDDR的基因產物可經二硫鍵與三葉草蛋白家族成員TFF1結合形成異源二聚體，因此GDDR 又名為TFIZ1［trefoil factor interaction(z)1］［3］。此外，這個家族的第3 個成員GKN3，不像GKN1 和GKN2 是有功能的，GKN3 在人體內是作為無效的假基因存在的。然而，GKN3 在大量其他的哺乳動物，包括小鼠中都發揮出功能。已知的證據顯示，GKNs 在調節胃上皮動態平衡及在幽門螺旋桿菌對宿主的免疫反應中都具有重要的作用，而且，由于其表現出抗增殖作用，被認為可以抑制腫瘤發展。尤其是GKN2 和胃特異性腫瘤抑制蛋白三葉因子(TFF1)之間已知的相互作用很關鍵。

一、基因結構

在哺乳動物中GKN 是高度保守的直系同源物，但在魚類或昆蟲中一直沒有描述，因此，推測GKNs是高級脊椎動物的進化創新。迄今為止，在所有的哺乳動物研究中，基因組水平的3 個GKN 基因旁系同源物顯示他們嚴格保守，它們被緊緊地聚集在一起［4］。人類GKN 基因位于染色體2p13.3。GKN3 基因在鼠科動物中定位于染色體6qD1。

二、蛋白質結構與BRICHOS 域

GKN 基因編碼小(181 ～184 個氨基酸)的蛋白質。除了具有類似的相對分子質量，GKN 蛋白也有統一的結構特征，最顯眼的是神秘的BRICHOS 域和一個羧基末端片段，這顯示了GKN 有高度保守的氨基酸序列。GKN 蛋白質的最鮮明的結構特征是該BRICHOS 域，它是1 個100 個氨基酸的序列，它被一小部分的無相關性的蛋白質所共享。雖然數量不多，但BRICHOS 蛋白質具有重要的臨床意義，它與人類疾病如癡呆、呼吸系統疾病、癌癥有聯系［5］。關于BRICHOS 域蛋白與人類疾病相關聯的數據越來越多，這對GKN 的了解起了關鍵性作用。分子研究進一步闡明了BRICHOS 域的功能，它參與細胞內運輸、加工肽、分子伴侶功能/蛋白質折疊、分泌等。BRICHOS 域的3 級結構是高度保守的，并且有相似的重要功能。盡管整體上共享重要的同源性結構，個別GKN 旁系卻有少量的結構進化。雖然沒有經驗證明，這些結構變化一定會影響GKN 功能。這方面最顯著的證據是半胱氨酸38 在所有哺乳動物GKN2 直系同源基因中存在，但在GKN1 或GKN3 中卻沒有。總之，GKNs 享有強大的結構同源性意味著它們在體內密切相關，然而，其中個別成員有獨特的功能也正是進化所產生的結果。

三、GKNs 在正常組織中表達

GKNs 表達的主要部位是胃，除少量在子宮、胎盤和十二指腸散在表達［6，7］。同樣的，GDDR 在胃腸道高度表達，包括小腸、胃、胰腺、直腸和結腸，而它不存在于心臟、骨骼肌、肝、脾和腦中，證明它在正常胃腸道黏膜特異性表達。因為GKN3 在人類中是缺失的，所以常在小鼠中進行GKN3 的研究，研究顯示GKN3 蛋白和mRNA 在胃竇腺細胞、胃底黏膜頸部亞群細胞(MNCs)和十二指腸布倫納腺中表達。

四、在胃腫瘤中的表達以及其對胃腫瘤的影響

GKN1 和GKN2 在胃癌中明顯下調［8，9］。已知的研究提示GKNs 可能作為胃特異性的腫瘤抑制基因，意味著其在臨床預測和診斷中有潛在效用［10］。GKN1 在胃腫瘤中表達減少是在做正常胃組織黏膜和胃腫瘤的差異篩選分析法中被首次發現。有研究表明，GKN1 在彌漫型胃癌中缺失，腸型胃癌中缺失，而GKN2 類似GKN1，其缺失的頻率在彌漫型胃癌和腸型胃癌中分別為85%和54%，總體而言，GKN1 的表達缺失與GKN2 呈正相關［10］。除了胃腫瘤組織，GKN1 在胃癌細胞系中也普遍缺失，在7 個胃癌細胞系(MKN28、MKN45、AGS、N87、SNU 1、SNU 16 和KATO)中GKN1 表達均顯著下調或缺失，GKN2 被證實在AGS、KATO Ⅲ和HCT-1 胃癌細胞系中表達完全缺失，而在SGC - 7901、N87、MKN45、MGC803 和BGC823 細胞中表達顯著下調或缺失［11］。

GKN1 可能在胃癌的形成和發展中作為一種抑癌基因發揮顯著的作用［6］。GKN1 在胃黏膜的防御機制中起著重要的作用，它是胃黏液層的組成成分之一。GKN1 基因可能通過抑制上皮-間質轉化(epithelial - mesenchymal transition，EMT)和腫瘤細胞的遷移發揮重要作用［12］。GKN1 還可以通過激活p16/Rb 通路誘導胃癌細胞發生衰老［13］。因此，GKN1 基因失活可促進胃癌細胞增生，且在胃癌細胞的惡性轉化中發揮啟動作用［12］。GKN1 蛋白可以抑制胃癌細胞的生長［6］。關于GKN2 的研究顯示，GKN2 基因的瞬時表達可以抑制胃癌細胞的增生。GKN2 蛋白在胃表面黏膜上皮的細胞質中表達，具有維持胃黏膜完整和促進受損黏膜的修復以及調節胃黏膜上皮細胞增生和凋亡的作用［1］。人正常胃黏膜上皮中可分離出一種相對分子質量約25kDa 的復合物，具有保護和修復胃黏膜的作用，這種復合物是由GKN2 及TFF1之間通過二硫鍵結合而生成的一個異源二聚體復合物［3］。但在胃癌細胞中GKN2 的表達或缺失，導致TFF1 -GKN2 異二聚體形成減少，使TFF1 失去正常的功能從而促進腫瘤的發生、發展［14］。因此，GKN2可作為監控胃癌患者疾病進展和預測預后的指標。GKN2 的過表達可以抑制胃癌細胞增生、遷移和侵襲，并使細胞周期阻滯在G1～S 期。另外一種胃動蛋白GKN3，在人類基因中也存在表達缺失。在遠端胃GKN3 編碼的是與TFF-2(三葉因子2)共表達的分泌蛋白，并且能夠識別一種在近端胃的Griffinia simplicifolialectin(GS)-Ⅱ-陽性頸黏液細胞(MNC)亞群。GKN3 編碼一種與GKN1 和GKN2 功能不同的GKN，并且其過度表達可能抑制胃黏膜萎縮中的上皮細胞增生。

五、GKNs 在胃炎和癌前疾病中表達

胃炎至胃癌的組織病理學進程是慢性胃炎，胃黏膜萎縮，腸上皮化生，不典型增生和最終的胃癌。幾個研究小組已經表明，幽門螺桿菌感染的胃黏膜組織中GKN1 和GKN2 表達下調。GKN1 表達在正常黏膜、炎癥、癌前組織、癌組織中逐步減少。胃黏膜損傷后，在GKN1 的存在下胃黏膜很快恢復。相反，如果該蛋白下調，修復過程受影響。這些研究結果表明，Hp 慢性持續性感染導致GKN1 的表達減少，它的表達在幽門螺桿菌根除后上調［15］。動物實驗也表明，傳統的非甾體類抗炎藥可通過減少GKN1 的表達從而誘導胃損傷。總之，已有的數據表明，GKN1 表達可能與胃黏膜的炎癥損傷有關。

GKN2 被確定為一個胃黏膜TFF2 的結合配偶體。據報道該GKN2 的表達在幽門螺桿菌感染性胃炎和胃癌中降低。正常人胃部GKN2 呈內源性高表達，但在幽門螺桿菌(helicobacter pylori，Hp)感染胃部直至形成胃癌的期間GKN2 顯示出漸進性的表達缺失，研究顯示，在胃炎基礎上發生胃癌的鼠模型中GKN2 基因表達被顯著抑制，該腫瘤增生與促炎性因子的驅動及致癌的轉錄因子STAT3 的活化相關。相反，人類胃組織芯片研究顯示，根除慢性Hp 感染后GKN2 在所有上調轉錄組基因中表達上調最為明顯。IL-1β、TNF-α、IFN -γ 及IL -6 這些促炎性因子在胃癌細胞系中可以下調GKN2 基因的表達［2］。

幽門螺旋桿菌定殖胃上皮誘導的炎性反應使活性氧的生成和一氧化氮水平增加，可能影響DNA 和突變最終導致胃癌。有報道GKN1 表達抑制NF-κB的活化和核轉位，而NF-κB 是連接胃炎和胃癌的關鍵機制［16］。胃黏膜受損是由于攻擊因子壓倒黏膜防御的結果，一旦攻擊因子壓倒黏膜防御，胃黏膜的完整性可能會遭到破壞。幽門螺桿菌(Hp)感染被證實會損傷胃黏膜，是慢性胃炎和消化性潰瘍最常見的病因。有研究表明，GKN1、GKN2 在表面胃上皮細胞和腺的上半部分大量表達，但不存在于較深胃腺，這表明GKN1 可能發揮胃黏膜的防御屏障的作用。

六、GKNs 與TFF 的關系

GKN 和三葉因子家族是在正常胃黏膜上皮細胞中大量特異性表達且結構和功能密切相關的兩個蛋白家族。三葉因子家族(TFF)肽是胃黏膜上皮細胞主要分泌產物，它在細胞保護、細胞凋亡、免疫應答中發揮多種作用，且它在胃中調節黏膜修復和抑制腫瘤的形成。TFF1 缺乏可促使胃癌發生，而TFF2 缺乏增加胃竇炎，TFF2 也在一些人體胃腺癌病例中下調。在人類組織樣品，TFF2 啟動子DNA 的甲基化在幽門螺旋桿菌感染的時間開始和在整個胃腫瘤進展的過程中增加。TFF3 在非腫瘤胃黏膜中的表達是罕見的，但在大約50%的胃癌中發生。

研究首先發現GKN2 和TFF1 的聯系，不同于其他家族成員，GKN2 含有一個38 位的半胱氨酸殘基，其間的二硫鍵就是由位于TFF1 58 位的半胱氨酸殘基和它的這個半胱氨酸殘基構成，連接形成的二聚體復合物［17］。一些報告表明，在實驗鼠中GKN2 和TFF2 也以非共價鍵結合。該GKN2 的表達，平行于該TFF 基因，表明它們可以一起在維持胃腸道穩態中發揮重要作用。胃癌中GKN2 與TFF1 蛋白的共表達遭到破壞時，GKN2 表達缺失時誘導TFF1 表達恢復能促進胃癌侵襲和轉移。此外，GKN2 可以通過抑制GKN1 來調節胃黏膜的動態平衡［18］。GKN3 過表達可以抑制細胞增生。GKN3 編碼的蛋白質和三葉因子(TFF)2 在正常胃黏膜上皮中共表達，在胃萎縮中高表達，但二者沒有通過二硫鍵形成異二聚體，免疫共沉淀反應也驗證了這一點［4］。

七、展 望

當前的實驗資料表明胃動蛋白與多種疾病發生相關，且是胃組織特異性的抑癌基因，它在正常胃組織中表達，而在大多數胃癌及癌前病變中表達下調或缺失，并且和幽門螺桿菌感染，三葉草因子家族等存在著復雜聯系，在胃癌進展過程中發揮著重要作用。國內外研究者進行了大量研究，尤其是對GKN1 和胃癌關系進行了系統研究，但關于胃動蛋白家族的其他成員及胃動蛋白表達的作用機制卻不完全清楚，相信對以上問題進行深入研究將為胃癌的治療提供新的方向。

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