重癥肌無力實驗動物模型的研究進展

楊俊超(綜述)，文穎娟(審校)

(陜西中醫學院，陜西咸陽712046)

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種神經肌肉接頭傳遞性功能障礙所引起的自身免疫性疾病，這種疾病病變部位主要在神經肌肉接頭處突觸后膜上乙酰膽堿受體(acetylcholine receptors，AchR)，表現為神經肌肉接頭突觸后膜上的AchR自身抗體介導的特異性自身免疫疾病，由于抗體阻斷了這種神經肌肉的信號傳遞，產生了部分或全部骨骼肌易疲勞，呈波動性肌無力，活動后加重、休息后減輕、晨輕暮重等癥狀。為了進一步對人類MG發病機制有充分的認識，以便針對其不同的發病機制制訂相應的緩解或治療方案，現對近年來實驗性MG動物模型的制備進行綜述。

1 實驗動物的選擇

1.1 實驗動物的種屬 實驗動物在免疫實驗中作為人類的替身將在很大程度上影響實驗研究的成敗。常用的實驗動物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔和豬。大鼠由于抵抗傳染能力較強，在國內生物醫學研究領域中的廣泛應用和使用數量已超過小鼠而居首位。近交Lewis大鼠由于MG模型制備的易患性較強而作為目前常用大鼠［1］，且其發病有急性期和緩解期，表現為一種快速的發病進程故而適用于實驗研究。小鼠由于具有代表性的免疫系統，容易人為選擇性地控制小鼠的免疫條件，區分淋巴細胞的不同功能亞群，得到近交系群體等特點，所以也常用于免疫學實驗中。唐冰杉等［2］研究指出，近交系C57BL/6小鼠是比較公認的MG高敏感鼠，在免疫生物學中近交系小鼠C57BL/6是最為常用的小鼠。所以根據選擇實驗動物的近似性、重復性和均一性原則，動物種系的選擇現多采用無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級別的近交Lewis大鼠和近交系C57BL/6小鼠。

1.2 動物的性別和年齡選擇 醫學專家在大量的臨床觀察后指出，MG患者以20～40歲多見，女性略多于男性，占全部病例的55%～60%［3］，這可能與雌激素水平有關，故在誘導實驗性自身免疫性MG(experimental autoimmune MG，EAMG)的實驗中絕大多數選擇雌性動物。在實驗動物造模研究中，根據自身性免疫原理，B淋巴細胞對AchR的記憶作用會導致年齡大的小鼠的肌無力模型建立成功率下降，但是這種記憶反應可被誘導弱化，即在初次抗原致敏后行再次免疫接種可提高小鼠的致病率，所以MG模型建立多采用適齡的小鼠作為實驗對象［4］。

2 實驗動物模型的制備方法

2.1 以AchR全蛋白為免疫原建立EAMG動物模型 以AchR全蛋白為免疫原建立模型的方法國外很早就開始使用，1973年Patrick等［5］首先從電鰻電器官提取純化 AchR免疫接種新西蘭大白兔后制成了主動免疫的自身免疫性EAMG模型，后來在大鼠、小鼠中用同樣方法也制備了EAMG模型。這種從加利福尼亞電鰻器官中提取AchR是種天然的抗原，含有多個抗原決定簇，具有良好的免疫原性，能有效激活宿主的免疫系統［6］，但提取率低、提純的過程復雜而且昂貴，故而此種模型制備方法難以普及推廣使用。

2.2 采用合成AchR多肽片段為免疫原建立動物模型 由于天然AchR全蛋白不易獲取，所以開始嘗試用人工合成的方法來獲取蛋白，并且取得了比較理想的結果。早在20世紀80年代，Lennon等［7-8］用人工合成的電鰻 α 亞單位上的AchRα125-147接種Lewis鼠來誘導EAMG模型，在觀察MG臨床變化的同時做遲發型超敏反應實驗，結果表明，免疫的Lewis大鼠都有抗肽鏈抗體產生，出現了MG的臨床癥狀和電生理改變，T淋巴細胞能識別 AchRα125-147并產生免疫應答，產生肌無力的癥狀。

近年來，Baggi等［9-10］用大鼠AchR亞基多肽片段在Lewis大鼠上成功地誘導了EAMG模型，發現效果很好，陽性率達73.3%。孫辰婧［11］用重組人AchRα中提取的AchR肽段片段來免疫大小鼠取得了和全蛋白免疫相似的效果，都誘導出了典型的肌無力模型癥狀。孟和寶力高和額爾敦［12］通過使用AchRα亞甲基基因片段聯合白細胞介素6 DNA免疫原誘導Lewis鼠建立 EAMG模型，都取得了非常好的效果。Sun等［13］使用改進的方法重復性的重組人類骨骼肌AchR胞外域，獲得了大量的子代受體，可誘導出EAMG，探索出了更加方便、經濟的模型建立方法。

2.3 其他建立動物模型方法 除上述兩種方法外，后來又出現了轉移MG患者血清建立動物模型的方法，即用肌無力患者的血清及血清內成分注射到小鼠體內成功的建立出肌無力的動物模型［14］。包忠雷和閆曉波［15］在MG動物模型建立中提出，用處于急性期EAMG大鼠的AchR-Ab注射到Lewis大鼠來制備模型，但是此類模型不能從自身性免疫機制上模擬MG的發病情況，故而在臨床研究上都有一定局限性。Losen等［16］用雜交瘤技術制備AchR-mAb單克隆抗體并誘導Lewis大鼠建立模型，出現了對外界刺激反映遲鈍，體質量突然下降，成功地用 mAb35、mAbA7、mAbG10［17-18］等誘導制作出了EAMG動物模型。Richman等［19］發現，受體絡氨酸激酶是神經突觸受體的組成和功能維持的重要物質，并通過抵抗這種酶活性制備了肌無力模型。雖然這些模型制備方法都有成效，也有一定的臨床意義，但是尚處于實驗研究階段，還沒有建立起一套完善和規范的方案，穩定性和可重復性的把控還有待進一步研究。

3 評價動物模型建立的指標類型

3.1 臨床肌力評分方法標準 Lennon等［20］在20世紀80年代已經制訂出了比較科學的肌力評價標準分級方法，即將癥狀嚴重程度分為4級:0級，沒有肯定的無力表現;1級，撕咬無力，四肢力量較差，在光滑地面上前肢打滑，活動減少且易疲勞;2級，明顯無力，休息時身體呈隆起姿勢，頭尾下垂，大腿外展，前肢趾彎曲，動作笨拙，行走不穩;3級，嚴重無力表現，無撕咬動作，肌肉震頗，呼吸困難，瀕死或死亡。這種肌力的評價為以后評判標準的規范化奠定了基礎。雖然這種觀察法操作簡單，但是主觀性較強，容易產生評分級別誤差。近年來提出一種強迫運動法，即強迫實驗動物運動來觀察疲勞程度，如強迫動物反復抓握測量抓握肌力的抓握法，強迫動物游泳并記錄時間的游泳法和測量動物翻轉懸掛的停留時間的翻轉懸掛法。趙斌和劉降光［21］通過翻轉懸掛法測量動物的肌力情況，并用統計學單因素方差分析得出了較為顯著的結果，使肌力的評判變得更為客觀。

3.2 AchR 抗體(AchR antibodies，AchR-Ab)的測量 AchR-Ab是最早發現的MG患者的檢測指標之一，在MG診斷中已經作為一項最重要指標。EAMG患者血清中抗體的數量會明顯增多，雖然并非患者均會有血清抗體陽性反應，但是在發病的絕大多數患者體內，AchR-Ab還是一個關鍵的檢測指標，同時其滴度的大小還與疾病的嚴重程度呈正相關，因此抗體的檢測一直受到高度重視，也已經建立了標準化的檢測方法，即酶聯免疫吸附法。這種方法具有靈敏度高、特異性強、所用試劑穩定、容易標準化、批量化操作等優勢，已經得到了廣泛的定性和定量分析。Liu等［22］通過實驗研究表明，肌無力大鼠血清的免疫球蛋白含量增多，并提出減少免疫球蛋白的半衰期來治療肌無力。

3.3 血清膽紅素和尿酸的測量 周霞和孫中武［23］通過氧化酶定量分析法對MG患者血清膽紅素和尿酸水平的檢測，結果顯示，MG患者血清中間接膽紅素、總膽紅素和尿酸水平均顯著低于正常水平。這為評定MG模型的建立提供了更多的檢測方法，為MG的治療提供了新的思路和依據。

3.4 細胞免疫因子水平的檢測 Bakhiet等［24］在EAMG動物模型體內發現，輔助性的Th1細胞產生的干擾素γ、腫瘤壞死因子α等細胞因子可以活化B細胞，使EAMG癥狀加重。Feferman等［25］通過抑制肌無力模型動物體內的干擾素來減輕肌無力的癥狀取得了良好效果，Th2細胞分泌抗炎性細胞因子能減輕EAMG癥狀，而Th3細胞分泌的轉化生長因子β可以調節EAMG的癥狀表現。Uzawa等［26］對血清中的細胞因子白細胞介素4、白細胞介素15進行檢測，發現這種細胞因子在MG患者中明顯比正常人高，所以也可作為疾病檢測指標之一。

3.5 肌電圖電衰減反應的檢測 對于MG患者，肌電圖是常用的具有確診價值的診斷方法，在MG患者中有80%在低頻刺激時為陽性，且與病情輕重相關。肌電圖電衰減反應的檢測是目前最能反映神經肌肉接頭神經電生理變化的檢查方法。

3.6 骨骼肌病理形態學觀察 王輝和張平［27］通過彩色細胞圖像分析儀TJTY-400TC測量EAMG動物神經末梢面積、突觸前后膜長度及其比值、突觸前后膜面積，結果顯示，神經末梢(突觸前膜)變小、突觸間隙增寬，平均突觸后膜面積減小、突觸后膜長度變短，突觸后膜與前膜長度比值變小并且可見突觸后膜皺褶喪失或減少，AchR密度減少，殘余的突觸后膜皺褶中有抗體和免疫復合物的沉淀。Serra等［28］通過實驗表明，AchR形態的改變和Na+通道的異常會影響神經肌肉接頭處信號傳遞，產生肌無力癥狀。宋雅芳等［29］、文穎娟和李志華［30］和文穎娟等［31］研究發現，MG患者的肌肉組織結構會發生變化且線粒體結構和數目也會發生變化。另外，韓磊等［32］研究發現，MG患者的骨骼肌中線粒體跨膜電位會隨著后膜的損傷而降低。因此，這種通過透射電鏡和流式細胞儀對線粒體檢測也成為比較可信的檢測依據。

4 問題與展望

MG實驗動物模型的建立已經取得了很大進步，并且出現了多種模型制備方法，但也存在一些問題:①肌無力模型建立的方法雖多但不統一，沒有探索出一套操作簡單、復制率高、廉價容易推廣的方法。②模型建立的不夠典型，模型評判標準不統一，沒有形成一套能很客觀地評價模型成功與否的衡量標準。③檢測的指標也不夠多樣和合理，雖然很多指標可以作為肌無力的檢測指標，但是沒有探索出其發病的根本機制和根本變異參數指標。④現有研究建立的EAMG動物模型的造模方法所需時間都較長，研究發病迅速的MG動物模型的制備方法也將是一個新的方向。近年來有研究表明［33］，MG模型不僅出現了四肢肌肉肌無力現象，還出現了因心肌和呼吸肌衰亡的致死現象，胃腸平滑肌的功能障礙出現胃腸蠕動性障礙的現象，以及眼瞼下垂眼球運動障礙的現象，這將為模型的建立和肌無力機制的探討提供更多的方向、方法。并且近年來MG檢測方法也越來越多，涉及到線粒體、肌肉生成調控因子和基因片段損傷等多個領域，這將為進一步研究MG的發病機制以及探索MG治療提供新的方向。

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