囊胚培養的利與弊

周 紅(綜述)，張 波(審校)

(廣西壯族自治區婦幼保健院廣西婦產醫院廣西兒童醫院生殖中心，南寧530003)

人類輔助生殖技術的理想結局是生育一個健康胎兒，關注點不僅是臨床妊娠率，更在于單胎活產率。體外受精(in vitro fertilization，IVF)及其衍生技術發展已三十余年，胚胎成功植入與功能正常的囊胚、良好子宮容受性及其相互作用有關，因此對胚胎體外培養的研究逐漸細化而深入。研究顯示，與卵裂期胚胎移植相比，移植囊胚期胚胎臨床種植率較高，囊胚培養技術日益成熟，使移植胚胎策略逐漸向單囊胚移植傾斜，從而提高活產率、降低多胎率［1-2］。但受體外培養環境所限，并非所有高評分的卵裂期胚胎都能體外發育至囊胚期。在現階段，充分認識囊胚培養的利與弊，有利于獲得更好的助孕結局。現就囊胚培養的利與弊予以綜述。

1 囊胚培養的益處

1.1 胚胎的進一步篩選和修復人類胚胎培養發育首先是卵裂期胚胎，再到種植前囊胚期胚胎。其代謝有兩個不同階段，一是從受精到胚胎基因組的激活，二是從基因組激活到種植。通過動物及人胚胎的體外培養發現，早卵裂期胚胎形態學上的特點不能真正揭示胚胎本身的發育潛能和信息，體外繼續培養的過程中，沒有發育潛能的胚胎或攜帶有異常染色體和基因的胚胎常被自然篩選掉，只有質量好的胚胎才能發育至囊胚期［3-4］。Staessen等［5］研究提示，經過熒光原位雜交技術對不同階段胚胎非整倍體篩查的結果顯示，8細胞卵裂期胚胎染色體正常率為41.3%，而繼續培養至第5日囊胚期染色體正常率為65%，其種植機會增加，妊娠率高于卵裂期胚胎;部分染色體異常且質量差的胚胎在體外繼續培養，無法進一步發育。人類胚胎自然流產的首要原因與胚胎染色體的數目發生異常即非整倍體的產生有關。一項前瞻性研究對第3日診斷為非整倍體狀態的83個卵裂期胚胎繼續培養至第5日再做活檢，發現能發育至囊胚期的胚胎與發育至致密桑葚胚階段的胚胎相比有較高的自我糾正率(38.1%比24.2%)，說明隨著胚胎體外培養至囊胚期，其染色體異常(非整倍體和嵌合型胚胎)有可能獲得改善及修復，更佳地評估胚胎后基因組激活［6］。一項回顧性薈萃分析結果顯示，在IVF/卵胞質內單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技術中，與卵裂期胚胎移植相比，囊胚移植明顯增加活產率［7］。

1.2 子宮環境更適于胚胎種植 胚胎的成功植入需要功能正常的囊胚和良好的子宮內膜容受性，并且需兩者相互作用及多系統旁分泌的調控。人類子宮與輸卵管的環境分別適合不同類型胚胎發育，在自然妊娠中卵裂期胚胎在輸卵管發育，子宮種植最佳時期是囊胚期。在對胚胎干細胞的相關研究中提示，囊胚的形成從細胞融合到囊胚腔出現、擴張，經歷了從母體調節向胚胎調節的基因調控轉換［8］。自然妊娠中，胚胎種植于子宮的階段就是囊胚期，因此，囊胚期移植胚胎與子宮內膜的同步性更佳。Fanchin等［9］的研究表明，囊胚移植階段子宮收縮頻率明顯低于卵裂期胚胎移植階段［(1.5±0.2)次/min比(4.4±0.2)次/min］，該階段子宮收縮明顯減少，有利于避免胚胎被宮縮排出，更有利于胚胎種植。同時，囊胚期胚胎體積較大，子宮收縮較小，相關研究提示囊胚移植患者異位妊娠的發生率較低［10］。

1.3 單囊胚移植是可接受的移植策略 在IVF-胚胎移植中，由于無法真正預測胚胎的發育潛能，為了保證一定的臨床妊娠率，往往移植2～3枚卵裂期胚胎，通過增加移植胚胎數期望能增加妊娠率，因此，多胎妊娠風險明顯增加，多胎妊娠率可高達25%～50%，甚至出現較多的高序多胎妊娠［11］。一些隨訪資料提示，由于移植胚胎數目2～3個，致雙胎妊娠發生率增加了70%，三胎妊娠發生率增加了400%［12］。當胚胎培養到囊胚期，通過評估已分化的內細胞團及滋養外胚層，使選擇單個發育潛能高、較高種植率的囊胚進行移植成為可能，既可以得到較高的妊娠率，又能有效降低多胎妊娠率［13］。研究顯示，采取選擇性單囊胚移植策略干預后，移植胚胎數目明顯降低(由2.12枚減為1.60枚)，胚胎種植率及臨床妊娠率明顯提高，多胎妊娠率明顯降低(由29.37%降為15.38%)［14］。

1.4 體外延長培養提高胚胎利用率 按照現有的卵裂期胚胎形態學評分體系，取卵后第3日，對低評分的胚胎冷凍保存的意義不大，但對307枚低評分胚胎體外延長培養的研究提示，低評分胚胎體外延長培養后囊胚形成率為17.26%［15］。甄璟然等［16］的研究也認為，取卵后體外培養第3日形態學較低質量的胚胎仍有部分具有發育至囊胚的潛能(低質量胚胎總的囊胚形成率27.56%)，在第3日時對這些胚胎繼續進行培養至第6日，可能減少胚胎的浪費并得到更好臨床結局。另有學者研究提出，現有的胚胎評分方法在第3日認為無冷凍價值的非優質胚胎，仍具有不同程度的發育潛能，通過繼續體外培養，進一步篩選出具有發育潛能的胚胎，繼而冷凍保存囊胚，可提高患者的累積妊娠率，從而可以最大限度地利用胚胎，減少患者的損失［10，17］。

1.5 有利于胚胎植入前遺傳學診斷技術的開展 胚胎植入前遺傳學診斷是輔助生殖技術與遺傳學診斷技術相結合的技術，該技術的重要環節之一在于囊胚培養技術。胚胎活檢一般在胚胎發育的兩個時間段進行，一是在受精后第3日發育至6～8個細胞階段的卵裂期胚胎，取全能性的卵裂球1～2個細胞活檢，胚胎繼續培養發育形成囊胚，再根據活檢結果，選擇囊胚期胚胎進行移植;另一方面是胚胎培養至囊胚期，取胚胎滋養層細胞10個以上細胞進行活檢，不僅可增加可供診斷的細胞數，提高準確率，同時，取滋養層細胞活檢對胎兒發育的影響較小;但由于囊胚期活檢檢測結果后至，需要期待凍融周期移植［18］。

1.6 凍融囊胚復蘇率及著床率較高 胚胎冷凍保存是人類輔助生殖技術中不可缺少的一部分，在提高累積妊娠率、增加移植機會等方面起重要作用。在玻璃化冷凍保存胚胎體系不斷完善后，凍融囊胚的優勢體現在:①囊胚細胞數目多;②滋養層細胞損傷后修復能力強;③囊胚細胞小且表面積/體積比大，對脫水、復水造成的體積變化耐受性更佳;④囊胚復蘇后很快能判斷是否存活等［19］。研究表明，囊胚冷凍保存較卵裂期胚胎的復蘇率高、臨床種植率高［20］。因此，在囊胚移植數目減少的情況下，凍融囊胚復蘇可有效提高IVF技術的累積妊娠率及活產率。

2 囊胚培養面臨的問題

2.1 繼續培養需要更高標準的胚胎實驗室培養環境 胚胎體外培養，在不同時期對胚胎培養液成分的要求是不同的。卵裂期胚胎繼續培養，形成囊胚的影響因素很多，尤其對實驗室的體外培養體系有更高要求。胚胎在發育至8細胞水平晚期將發生致密化，為胚胎進一步細胞分化成滋養細胞和內細胞團奠定結構基礎。胚胎致密化后糖酵解成為重要的能量產生通路，胚胎此時對葡萄糖的利用度增加，有高度依賴性。從卵裂期胚胎到囊胚期胚胎還需要(如蛋白、氨基酸等)各種營養物質的均衡，培養液的滲透壓、溫度、酸堿度等的調節及胚胎實驗室優良的培養環境、無菌條件、人員操作、質控等，使實驗室工作量也因此增加［19，21］，同時繼續培養還應該盡量縮短胚胎在培養箱外暴露的時間，才能降低外界環境對胚胎的損傷。體外培養條件不良最終影響囊胚形成率及種植率、活產率。

2.2 體外延長培養有無囊胚形成而取消周期的風險 對高齡不孕婦女而言，獲卵數較少、形成胚胎較少，繼續培養最終無胚胎移植的周期取消率會明顯增高。Glujovsky等［22］分析顯示，囊胚移植在活產率方面優于卵裂期胚胎移植(32%比42%)，但囊胚移植組延長的培養可能無囊胚形成，移植取消的概率高，使卵裂期胚胎的累計妊娠率優于囊胚移植(56.8%比46.3%)，囊胚移植未顯現出明顯優勢。顧亦凡等［23］的研究顯示，人類發育欠佳胚胎僅有20.9%能培養到囊胚階段，有53.8%的患者由于繼續培養無囊胚形成而取消周期，因此，對于人類發育遲緩或形態不佳的胚胎，不建議繼續進行囊胚培養，盡量在第3日進行胚胎移植。

2.3 雙囊胚移植將產生更高的多胎妊娠率 囊胚的臨床種植率在40%～50%［18，24］，在我國，目前移植胚胎策略未針對移植囊胚的數目作出界定，雙囊胚移植在獲得可能高的臨床妊娠率的同時，必然導致醫源性的多胎妊娠率進一步增加，相應的臨床助孕的并發癥及產科風險增加。不孕夫婦受國家計劃生育相關政策限制只生一胎，患者不僅希望妊娠，也追求雙胎妊娠，往往難以接受單囊胚移植;當然，隨著單獨二胎政策的實施，這類情況可能會有所改善。Nyboe Andersen等［25］的研究指出，選擇性單胚胎移植與雙胚胎移植的累積活產率差異無統計學意義，但關鍵在于累積治療的周期數。

2.4 可能增加出生嬰兒性別偏倚及單卵雙胎的風險 囊胚培養、移植在很大程度上均是采用最優質胚胎進行移植，相對男性胚胎的發育速度顯著快于女性胎兒，是否因此導致男胎出生比率高，尚有爭議。Chang等［26］報道，囊胚移植導致男性嬰兒出生比例升高，且單卵雙胎發生率增加。但一些研究顯示，胚胎性別與胚胎形態學評級有關，與是否采取囊胚移植無關;延長胚胎體外培養發現，男性胚胎發育速度顯著快于女性胚胎，在5AA/6AA的囊胚中有72%為男性胚胎，三級胚胎中僅有40%為男性胚胎［27］。另外，造成單卵雙胎的具體原因仍不清楚，可能與婦女的年齡、卵巢刺激、體外延長培養、體外培養條件的改變以及透明帶的損傷等有關。一項對9篇文獻超過40 000個周期的薈萃分析表明，囊胚培養似乎是導致單卵雙胎的一個重要因素［24］。對ICSI的研究提示，囊胚期胚胎移植單卵雙胎發生率明顯高于卵裂期胚胎(3.9%比0.7%)［28］，推測對透明帶的操作及輔助孵化處理可能是囊胚移植單卵雙胎發生率增加的原因。而Papanikolaou等［29］對1951例新鮮IVF/ICSI周期的回顧性研究表明，與卵裂期單胚胎移植相比，單囊胚移植并不增加單卵雙胎的風險(2.6%比1.8%)。另有研究顯示，移植囊胚與卵裂期胚胎單卵雙胎率無差異，囊胚培養并未增加單卵雙胎的發生率［14］。單卵雙胎的發生可能與輔助生殖技術中的一些操作(如輔助孵化、ICSI、胚胎活檢等)相關，但與囊胚培養的相關性尚需進一步研究。

2.5 基因印記異常風險可能隨體外培養時間延長而增加在輔助生殖技術中，IVF、胚胎體外培養的過程是基因印跡擦除、建立和維持的關鍵窗口期，體外環境可能干擾胚胎基因印記，導致相關遺傳性疾病的發生率上升。一些研究發現，基因印記缺陷可能與母系位點低甲基化、超排卵和胚胎體外培養有關［30］。在許多動物研究發現，對胚胎的延長培養、培養環境及培養液成分等的變化，可能導致印跡基因的改變［31］。一項對小鼠單個囊胚DNA甲基化的微陣列分析結果表明，體外培養過程、囊胚冷凍的人工皺縮技術、冷凍保存等可能產生廣泛的基因效應［32］。囊胚培養增加了胚胎體外操作及培養的時間，囊胚內細胞團對培養液中的成分變化更敏感，對培養基耐受性較差，可能潛在損傷更多。

3 選擇性囊胚培養與單囊胚移植使其優勢最大化

人類輔助生殖技術的應用，終極目標是輔助生殖回歸自然。囊胚培養、移植的主要優勢在于其是有效、易行的胚胎選擇方法，并有較高的種植率，使單胚胎移植效率提高，并提高累積妊娠率及活產率。因此，胚胎實驗室培養環境在滿足囊胚培養的更高要求后，對于年輕、卵巢反應好的患者，選擇性單囊胚移植應該是較有效率的助孕策略。另一方面，對于卵巢反應差、胚胎數量少的患者，考慮到繼續培養的風險，可能依然是采用卵裂期胚胎移植更為合適。

4 小結

正確看待囊胚培養的利弊，利用有效胚胎體外培養體系進一步篩選胚胎，充分發揮IVF技術優勢，結合臨床促排卵與子宮內膜等方案選擇的探索，選擇性地將具有高發育潛能的單個囊胚移植到適宜種植的子宮內，既維持可接受的臨床妊娠率，又有效控制了多胎妊娠率，最終實現單胎活產，達到輔助生殖技術的理想目標。

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