類風濕因子對免疫測定干擾的研究進展

謝良才，劉天春(綜述)，范 文※，許 蓉(審校)

(長江大學附屬第一醫院 a.檢驗科，b.骨外科，湖北荊州434000)

類風濕因子(rheumatoid factors，RF)是一種臨床常見的自身抗體，常作為類風濕關節炎的重要診斷指標之一［1］，但同樣出現在其他自身免疫性疾病［2-3］、感染性疾病［3-4］，甚至健康人血液中［5］。RF是常見的免疫測定干擾物之一［3］，盡管RF對免疫檢測的干擾發生率并不高，但RF干擾的潛在性和嚴重危害性應引起實驗室工作人員和臨床醫師的足夠重視和警覺。目前相關研究多限于臨床個案的分析和報道，現主要闡述RF對各類不同種類的免疫測定干擾產生的機制及不同的干擾類型，同時闡述干擾的發現、鑒別、處理及減少RF干擾發生的措施，為消除或減少RF對免疫檢測的干擾提供參考。

1 RF對免疫測定的干擾

1.1 RF干擾的檢測項目 RF對許多免疫測定項目存在干擾。內分泌類:甲狀腺激素［6］、甲狀旁腺激素［7］;腫瘤標志物:糖類抗原 19.9［8］、糖類抗原 125［9］;心肌標志物:腦鈉肽［10］、肌鈣蛋白Ⅰ［11］;特異性微生物標志物:乙型肝炎表面抗原［12］、丙型肝炎病毒抗體［13］、風疹特異性免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)M 抗體［14］、結核分枝桿菌抗體［15］;其他:細胞因子［16］、C 反應蛋白［17］及一些藥物［18］等。

1.2 對雙抗體夾心法免疫檢測的干擾

1.2.1 正干擾(假性增高/假陽性) 雙抗體夾心法用于大部分抗原、蛋白、激素及藥物的檢測。研究證實，RF對基于雙抗體夾心法的酶聯免疫吸附法［12，19］、固相放射免疫［14］、化學發光法［10，20-21］、微粒子免疫分析［22］等檢查系統，均存在不同程度的正性干擾。RF對雙抗體夾心法檢測系統干擾的可能機制為:雙抗體夾心法檢測系統中的捕獲抗體和信號抗體一般均為IgG，當樣本中的RF能同時與這兩種抗體Fc段結合時，便會將捕獲抗體與信號抗體橋接，形成捕獲抗體-RF-信號抗體的復合物，從而產生非特異性的檢測信號，造成檢測結果的假性增高或假陽性［16，19］，引起這種干擾的可能是IgM-RF、IgG-RF或者其他型別。

1.2.2 負干擾(假性降低/假陰性)RF對雙抗體夾心法的免疫分析系統的負干擾在一些文獻中被提出［23］，但被試驗或臨床證實的報道較少［19，24-25］。RF對免疫測定系統負干擾的機制，主要是空間位阻(屏蔽)假說［25］，即當RF只能與捕獲或信號抗體中的某一種抗體結合時，會形成空間位阻(屏蔽)，阻礙捕獲抗體-抗原-信號抗體復合物的形成，造成檢測信號的減弱或缺失，引起假性降低或假陰性的檢測結果［24-25］。對于一些三位點免疫檢測法，其干擾發生的機制與雙抗體夾心法是相似的。由于同時使用兩種捕獲抗體(或兩種信號抗體)，雖然增加了檢測的敏感性，但同時也增加了干擾發生率。

1.3 RF對捕獲法檢測IgM類抗體的干擾 捕獲法檢測IgM的干擾目前僅見假性增高的報道［13-14］，是否有假性降低的可能尚有待進一步研究。RF對捕獲法干擾有兩種可能的機制，一種是由IgM-RF引起，由于第一步IgM的捕獲是非特異性的，IgM-RF同樣被捕獲，被捕獲的IgM-RF最后與信號抗體(IgG或IgG的抗原抗體復合物)結合，產生檢測信號;另一種機制則與雙抗體夾心法類似，由RF直接將捕獲抗體和信號抗體橋接，同樣會引起假性增高或假陽性。這兩種機制由哪一種主導目前尚缺乏相關研究和報道。

1.4 RF對其他免疫測定的干擾 RF干擾免疫比濁法和乳膠光度免疫分析法也有報道，RF對免疫比濁法干擾機制主要是發生在反應的第二步，增加抗原抗體復合物聚集形成多聚體，引起檢測結果的假性增高［17］。

2 RF對免疫測定系統的干擾特點

2.1 干擾的發生具有隨機性 RF對免疫測定系統的干擾是由RF與檢測系統中抗體(主要是IgG)Fc段的非特異性結合引起的，但這種非特異性的結合并不是絕對的。某一個體，RF的干擾沒有規律可循。而其中的原因可能與RF自身的特異性和同系的特異性有關，一種RF不能與所有的IgG分子Fc部分的抗原結合，只有當RF抗原的決定簇與IgG分子上Fc段對應的空間結構有互補性時才有可能結合，所以RF與IgG Fc段的結合是隨機的，沒有結合規律可循。因此，某一標本中的RF是否能夠引起檢測系統的干擾，事前無法預料到［26］。

2.2 干擾程度與RF濃度的劑量效應不明確 無論高濃度還是低濃度的RF均會對免疫檢測引起干擾。盡管某些研究證實高濃度的RF較低濃度的RF更易引起干擾，但干擾發生與RF濃度的量效關系目前尚不明確［24-26］。一方面是由于RF本身有IgM、IgG、IgA、IgD、IgE等多種成分，干擾是由哪種或哪幾種成分引起，各種成分的干擾效果等均有待進一步研究;另一方面是由于RF能夠自身發生聚集，而形成多聚體;另外，RF可與天然IgG反應，但與凝集IgG及免疫復合物中變性IgG親和力更強［24］。因此，干擾程度可能與分析物濃度也有一定的相關性(因為這些分析物會與檢測系統抗體形成抗原抗體復合物)［26］。

3 干擾的發現和確認

3.1 追溯用于檢測干擾抗體的存在 結果追溯是指當化驗結果受到質疑(因與臨床結果不符或超過極端限制的分析結果)時，在發出報告結果之前，依據完善的機制或程序，追索確認干擾的存在［27］。干擾的可能性應始終考慮，即使在管理最好的實驗室，尤其當結果出現與臨床表現不符合時，早期的調查始終是可取的［28］。追溯方法有明顯的缺點，比如很多檢測結果本身病理、生理下會出現大的生物學差異，缺乏充分的臨床資料及臨床表現的復雜性。因此，利用生理學上不合理的閾值做判斷，提醒技術人員所有免疫檢測的潛在干擾是不實際的。

3.2 積極的用于確認干擾抗體存在的方法

3.2.1 樣本連續稀釋法 通過對分析樣本進行連續稀釋，分析稀釋系數與濃度梯度改變的線性關系，是較為簡單、可行的用于干擾發現和鑒別的方法［10，29］。例如，有報道，利用稀釋法可較好地消除由于異嗜性抗體引起的雅培化學發光檢測系統測定血清人絨毛膜促性腺激素的干擾［30］。

3.2.2 加標或加樣回收實驗 加標或加樣回收實驗也可鑒定和確認干擾的存在與否［29］。通過向檢測樣本中加入已知量的分析物，計算回收率，如果回收率在檢測系統預定回收率范圍內，可排除干擾的存在;如果回收率遠高于檢測系統正常回收率，提示檢測結果偏高，樣本檢測結果可能存在假性增高;如果回收率遠低于檢測系統正常回收率，提示檢測結果偏低，樣本檢測結果可能存在假性降低［10］。

3.2.3 使用不同方法學或不同廠商的檢測系統復查 使用不同方法學或不同廠商的檢測系統復查，尋找與測量的替代方法之間的差異［27，31］。由于RF對檢測系統的干擾是偶然的，不同檢查系統試劑中使用的抗體有一定的差異，因此同一樣本對一種檢測系統有干擾，但對另一檢測系統干擾不一定存在。所以對于一些樣本，尤其是當初次檢測結果與臨床不符時，可采取更換檢測系統的方法復查樣本，以發現和確認干擾。

3.3 其他發現鑒別干擾存在的方法 對于在生理、病理、臨床上有相關性的項目(如肌酸激酶及其同工酶與肌鈣蛋白、乙型肝炎e抗原與乙型肝炎表面抗原等)，比較相關檢測項目結果之間的一致性也是發現干擾的方法之一。另一種積極的做法是要求提供相關病史(如風濕病史)。實施這一方法也較為困難，且很可能是無效的，因為在未知干擾發生率、程度及干擾物量效關系等信息時，很難預測干擾發生與否。對所有待檢樣本進行盲篩也是不可取的。實驗室和臨床工作人員之間應建立良好的溝通，以最大限度地減少因意料之外的干擾而造成錯誤檢測結果的風險。

4 干擾的處理

4.1 樣本前處理 在檢測和分析前對樣本進行預處理以消除或盡可能降低樣本中的RF，以達到消除或降低RF對檢測系統的干擾。常用的樣本預處理方法包括:分析前在樣本中加入動物血清或 IgG［7，19］或加入封閉阻斷試劑［32］;用包被IgG 的 固 體 顆 粒 吸 附［10，26］;使 用 阻 斷 試 管 采 集 檢 測 樣本［23，33］;使用聚乙二醇 6000［34］處理樣本，這樣的選擇有一個很好的理由，因為與IgG結合形成復合物而干擾免疫檢測的RF主要成分被認為是多克隆IgM型RF，而與聚乙二醇6000沉淀的主要是此類較大的復合物，而對其他小分子單體RF沉淀很少;用蛋白L沉淀［16，35］，但價格較高，使得L蛋白不可能用于臨床試驗。盡管這些方法在減少或消除RF干擾方面被證實是有效的，且其中一些方法也較為簡單實用，但這些預處理方法已被證實并不是對所有RF樣本都有效［19，26，36］。

4.2 改進檢測系統 利用抗體工程，在免疫測定中截斷Fc部分(RF的結合位點)，僅保留Fab段的抗體作為檢測試劑，或使用活體的生物素單鏈是一個較為理想的解決RF干擾的方法［37-39］。但檢測系統中，無論是捕獲抗體的包被固化，還是信號抗體的標記，多在抗體的Fc段，這樣的修改可能增加抗體的包被和標記的難度，在工程上依然有一定的困難，因此，目前市場上也無此類檢測系統，但其可能成為今后抗體免疫檢測抗干擾研究的方向之一［37］。也有報道，RF不與卵黃抗體反應，如果將捕獲抗體或信號抗體(或兩者)使用卵黃抗體，能夠避免 RF 的干擾［40］。

5 小結

盡管對RF免疫檢測干擾的研究有了很大的進步，并提出很多干擾鑒定和解決的方法，但到目前為止還沒有一種方法可徹底消除RF的干擾。當出現與臨床不符的可疑結果時，檢驗人員應立即告知實驗室負責人，及時與臨床聯系，尋找干擾原因，運用多種檢驗技術進行檢驗，力求得出較為準確的結果。相信隨著RF相關干擾的進一步研究及免疫檢測技術、抗體工程技術的發展，在不久的將來能徹底解決由此帶來的困擾。

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