TGF-β1相關microRNA在糖尿病腎病發病機制中的研究進展

王勾琴，周小春(綜述)，王儉勤(審校)

(蘭州大學第二醫院腎內科，蘭州 730000)

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TGF-β1相關microRNA在糖尿病腎病發病機制中的研究進展

王勾琴△，周小春△(綜述)，王儉勤※(審校)

(蘭州大學第二醫院腎內科，蘭州 730000)

摘要：糖尿病腎病(DN)為糖尿病全身微血管并發癥之一，由于目前缺乏針對DN有效的治療方法，主要依靠藥物延緩疾病進展或通過血液凈化和腎移植等腎臟替代治療維持生命，所以探索疾病的早期標志物及有效治療方法對改善DN患者的預后非常重要。微RNA(miRNAs)在細胞增殖、分化、凋亡及癌變等病理生理過程中起重要作用。目前研究發現，miRNAs參與DN的發病機制，而轉化生長因子β1介導多種miRNAs在DN中表達。

關鍵詞：糖尿病腎病；微RNA；轉化生長因子β1；發病機制

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見微血管并發癥之一，也是導致終末期腎臟病的主要原因。雖然通過嚴格的藥物治療能延緩DN的進展，但仍然缺乏有效的治療手段阻止DN患者向終末期腎臟病階段進展[1]。因此，有必要更深刻地探討DN的發病機制及有效治療方法。微RNA(microRNA，miRNA)是近年來發現的一種內源性非編碼RNA，通過與靶基因信使RNA的3′非編碼區堿基互補結合，抑制翻譯水平，阻遏蛋白質合成。轉化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)是DN發生、發展的關鍵調節因子。目前的研究發現，TGF-β1通過調節miRNAs在糖尿病腎組織中的異常表達，介導DN纖維化病理改變[2-3]。因此，探索TGF-β1介導的miRNAs在DN中的具體作用有助于進一步認識DN的發病機制。現就TGF-β1相關miRNA在DN病理機制中的作用予以綜述。

1miRNA簡介

miRNA是長度為21～24個核苷酸的單鏈非編碼RNA，廣泛存在于植物及動物體內，通過與靶基因信使RNA的3′非編碼區堿基互補結合，起降解信使RNA或抑制靶基因翻譯的作用。根據最新miRbase的統計數字，目前已有2500個人類miRNAs被證實,估計至少靶向調節60%的蛋白編碼基因[4]。針對哺乳動物的研究表明，miRNAs參與腫瘤的發生，細胞凋亡、分化、免疫應答及胰島素分泌等一系列生物學過程[5-7]。miRNAs的調節異常與心血管疾病、神經系統功能紊亂及某些腫瘤的發生關系密切。近年來，miRNAs在腎臟領域的研究報道也不斷涌現，例如，特異性剔除小鼠足細胞Dicer酶的研究報道顯示，剔除Dicer酶導致miRNAs的丟失可觸發大量蛋白尿、足細胞損傷及腎臟纖維化改變，可以看出足細胞中的miRNAs 在維持腎臟的正常結構及功能方面起重要作用[8]。miRNAs作為關鍵的調控因子參與DN的發生、發展，并且幾種與DN發生有密切關系的miRNA已經被證實[2-3,9]。

2TGF-β1在糖尿病腎病分子機制中的作用

在糖尿病的病程中各種糖代謝異常副產物，如糖基化終末產物、活性氧及蛋白激酶C均可激活TGF-β1信號通路誘導腎臟纖維化改變。TGF-β1作為一種重要的中介者，在介導DN細胞外基質沉積的過程中起重要作用，通過抑制TGF-β1的表達或使用中和性抗體阻截TGF-β1可減輕腎臟纖維化程度[10]。此外，TGF-β1基因多態性與DN的易患風險相關[11]。TGF-β1通過與受體結合，觸發Smad依賴及Smad非依賴信號通路，從而發揮對下游基因的轉錄調控作用[12]。目前針對TGF-β1的生物學研究揭示，TGF-β1作為一種上游調控因子還可以通過調節miRNAs的異常表達使腎臟發生纖維化病理改變；TGF-β1可上調miR-21[13]、miR- 192[14]、miR-377[15]、miR-216a/217[16]及miR-215[17]的表達；下調miR-29[18]、miR-200[19]的表達。

3TGF-β1相關miRNA與糖尿病腎病分子機制的聯系

3.1miR-192目前針對miR-192的研究仍存在爭議，Kato等[20]在DN動物模型的腎組織及TGF-β1處理的腎小球系膜細胞中發現miR-192的表達豐度明顯升高，且具有促纖維化作用。由于miR-192的啟動子序列含有Smad3及p53的結合序列，TGF-β1主要通過Smad3經典信號通路及p53兩種機制誘導miR-192表達[14]。miR-192和miR-200均可通過負性調節蛋白鋅指E盒結合同源盒蛋白(Zeb1/Zeb2)參與TGF-β1介導的內皮間質轉換；抑制小鼠系膜細胞中的miR-192 可明顯降低miR-200b/c、Col1a2、Col4a1及TGF-β1的表達量[2]。然而，與上述研究結果相反，Kato等[16]通過實驗發現，TGF-β1可抑制腎小管上皮細胞表達miR-192，且miR-192 在DN患者的腎組織中也呈低表達，miR-192的缺失可加重DN腎臟纖維化程度；研究還發現，低豐度的miR-192與腎小管間質纖維化及低腎小球濾過率相關。由此可見，miRNAs在DN中的調控機制極為復雜，因此miRNA-192在DN中的作用機制還需進一步探索。

3.2miR-21miR-21在正常腎組織呈低表達，在人類及動物模型的急性及慢性腎臟疾病的腎組織中呈高表達，在糖尿病小鼠的腎小球及腎小管間質組織中呈明顯上調表達，同樣在缺血/再灌注的腎組織中表達豐度也明顯升高[13,21]。Chau等[21]通過動物腎臟基因表達譜分析發現，miR-21通過負性調節靶基因過氧化物酶體增殖物激活受體α，沉默脂質代謝及氧化還原等代謝通路，促進腎臟纖維化。在高糖狀態下，miR-21參與腎臟損傷的機制與調控靶基因的表達及促使TGF-β1的信號活化有關[3,13]。miR-21直接靶向抑制Smad7，激活TGF-β/Smad3經典途徑。Smad7作為一種保護性因子在DN的小鼠模型中明顯降低，通過阻滯Smad3的活化及抑制核因子κB抑制因子α(inhibitor of nuclear factor kappa-Bα,IκBα)的生成，阻止TGF-β及核因子κB信號通路活化起抗纖維化及抗炎等功能[13]。此外，miR-21通過負性調節靶基因磷酸酶與張力蛋白同源物擴大TGF-β誘導的磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3Ks)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信號通路活性，刺激下游轉錄共激活因子，導致系膜細胞、腎小管上皮細胞肥大及纖維粘連蛋白表達增加[3]。PI3Ks/Akt信號通路的活化可使基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)2上調表達，MMP-2與金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)共同調控細胞外基質的動態平穩。研究表明，miR-21還可以靶向抑制TIMP3的表達，在DN的小鼠模型中，miR-21上調可以明顯降低腎臟組織中的TIMP3，導致MMP-2的活性增強而TIMP3活性減弱，破壞細胞外基質的動態平穩，促進腎臟纖維化病變[22]。Wang等[23]通過實驗發現，miR-21還可靶向抑制MMP-9，間接升高TIMP1，破壞MMP-9/TIMP1的平衡。可見，miR-21通過幾種不同的信號通路在促進糖尿病腎臟損害過程中起著重要作用。

3.3miR-29與miR-192和miR-21不同，miR-29具有抗纖維作用。miR-29家族(miR-29a、miR-29b及miR-29c)含有相同的種子序列，抑制多種膠原纖維基因的表達，起抗纖維化作用。miR-29在正常的腎臟、肺及心臟中呈高水平表達，而在動物及人類發生纖維化病變的腎臟、心臟及肺中呈低水平表達[16-17，24-25]。此外，將培養的系膜細胞、腎小管上皮細胞及足細胞用TGF-β1處理或將其置于高糖環境下，miR-29家族的表達水平下降，且其表達豐度的降低可誘導腎臟纖維化標志物的表達[18]。miR-29是經典TGF-β/Smad3促纖維化信號通路的下游因子，Smad3通過與miR-29基因的啟動子結合抑制其轉錄；體內實驗也證實，miR-29在Smad3野生型及單側輸尿管梗阻性腎病老鼠的腎組織中明顯降低，而在剔除Smad3的單側輸尿管梗阻性腎病老鼠其表達量明顯上升，并且與前者相比，腎臟纖維化損害程度顯著改善[9]。miR-29靶基因為一組編碼與組織纖維化發生有關的基因，包括膠原纖維Col1a1、Col3a1、Col4a1、 Col5a1、Col5a2、Col5a3、Col7a1、Col8a1,MMP-2及整合素β1[18]。因此，在糖尿病狀態下，TGF-β/Smad3通過下調miR-29使一些與腎臟纖維化相關基因的抑制作用減弱，導致細胞外基質沉積，參與DN的發生、發展。然而，文獻報道，在高血糖狀態下miR-29c在腎小球內皮細胞及足細胞中高表達，研究人員在Ⅱ型DN小鼠的腎小球內得到相同的結果，并且剔除miR-29c可以防止DN的進展；研究人員發現，高表達的miR-29c能誘導足細胞凋亡，而剔除miR-29c可阻遏高糖狀態下足細胞的凋亡；研究還證實，Spry1為miR-29c的直接靶基因，Spry1與其相關蛋白通過非經典Wnt信號通路負性調節下游因子Rho激酶，Rho激酶通過多種信號通路涉及細胞的分化、纖維化及凋亡，并參與DN的發生及發展，抑制Rho激酶可以明顯減輕糖尿病動物模型的蛋白尿及細胞外基質蛋白沉積[26]。

3.4miR-200目前已經被證實的miR-200家族包括：miR-200a、miRNA-200b、miR-200c、miR-429及miR-141。根據其在染色體上的位置不同分為兩組：miR-200a/miR-200b/miR-429位于第1號染色體上，miR-200c/miR-141位于第12號染色體上，并且miR-141/miR-200a于TGF-β1處理的腎臟細胞及DN患者的腎組織中表達豐度下降[19]。miR-200具有抗纖維化的作用，其抗纖維化的作用基于抑制內皮-間質轉化病理變化。上皮鈣黏素作為細胞連接中心復合物維持上皮細胞的完整性。研究顯示，上皮鈣黏素表達的降低或缺失與腫瘤的分化、侵襲、轉移及預后密切相關；同時，上皮鈣黏素也是內皮-間質轉化中最為重要的因子之一，大量轉錄因子可以抑制上皮鈣黏素的表達從而導致內皮-間質轉化[27]。現已證實，miR-200通過結合于E盒結合鋅指蛋白(Zeb1/2)信使RNA的3′非編碼區，直接抑制Zeb1及Zeb2的翻譯，而Zeb1及Zeb2直接結合于上皮鈣黏素啟動子的E-box原件，抑制上皮鈣黏素的轉錄[28]。目前還發現,miR-141/ miR-200a還可通過負性調節TGF-β2抑制內皮-間質轉化的病理過程[19]。Xiong等[29]通過體內及體外實驗證實，TGF-β1通過Smad信號通路抑制miR-200的轉錄使腎臟發生內皮-間質轉化的病理改變，并用Smad7抑制TGF-β1/Smad信號通路可完全阻斷miR-200的下調。然而，與上述miR-200在DN中的表達豐度相反，目前有研究報道，miR-200b和miR-200c在糖尿病小鼠的腎小球及TGF-β1處理的系膜細胞中表達豐度升高[30]。Park等[2]發現，FOG2(friend of GATA2)為miR-200b/c的共同靶基因，在DN的動物模型及TGF-β1處理的系膜細胞中FOG2呈低表達，轉染miR-200b/c的腎小球系膜細胞明顯低表達FOG2，并且剔除FOG2的系膜細胞表現出明顯的肥大。FOG2是PI3K的抑制因子，PI3K為Akt的上游激動因子，在DN中PI3K/Akt活化可誘導細胞肥大及纖維化發生。有研究發現了TGF-β激活Akt的另一新機制，即通過miR-200b/c負性調節FOG2的表達從而刺激Akt活化[2]。

3.5miR-216a/miR-217TGF-β1與miR-192均可刺激非編碼RNA第二內含子區域(RP23)的啟動子，使 miR-216a、miR-217 的表達升高。人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同系物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)為miR-21、miR-216a及miR-217的共同靶基因，具有負性調節TGF-β介導的PI3K/Akt信號通路活性的作用，在腎臟組織中表現出抗纖維化的作用。相關研究表明，PTEN蛋白及信使RNA水平在糖尿病老鼠的腎組織中均明顯下降[16]。Kato等[30]研究發現，miR-216a的另一靶基因Ybx1(一種RNA結合蛋白)，具有抑制Tsc-22翻譯水平的作用，在TGF-β處理小鼠的系膜細胞中表達降低；Tsc-22為膠原纖維Col1a2基因E-box的增強因子，具有正性調節Col1a2表達的作用，在DN小鼠的腎組織及TGF-β1處理小鼠的系膜細胞中表達增高。miR-216a通過靶向抑制Ybx1，使Ybx1對Tsc-22的抑制作用減弱，最終導致與DN發病機制相關的Col1a2的產生增加。最近，Fiorentino等[22]證實miR-217另一靶基因TIMP3也參與DN纖維化過程。

3.6miRNA-377miR-377參與糖尿病所致的纖維蛋白產生及氧化應激反應。miR-377高表達于TGF-β1和高糖處理的人類及小鼠的系膜細胞中。miR-377通過靶向抑制超氧化物歧化酶及p21蛋白激酶，促進腎臟炎癥及氧化應激反應。miR-377抑制p21蛋白激酶信使RNA的翻譯與DN的關系可能是基于p21蛋白激酶改變絲裂原活化蛋白激酶及核因子κB的信號轉導通路有關，但目前p21蛋白激酶在DN中的具體分子機制尚不十分明確，還需進一步研究證實[15]。

3.7miR-215miR-215高表達于糖尿病小鼠動物模型，高血糖及TGF-β1可刺激系膜細胞表達miR-215[17]。重組人β聯蛋白互作蛋白1為miR-215的靶基因，具有負性調節Wnt/β聯蛋白信號通路的作用。Wnt/β聯蛋白信號通路在DN中處于異常活化狀態，參與系膜細胞的凋亡及足細胞的功能紊亂，并可誘導系膜細胞及腎小管上皮細胞發生內皮-間質轉化病理變化。因此，在DN中高表達的miR-215通過沉默重組人β聯蛋白互作蛋白1使其抑制Wnt/β聯蛋白信號通路的能力減弱，促進腎臟纖維化進展[17]。

4小結

由于不同的細胞類型在不同的腎臟疾病中對miRNA的反應不同，識別在特定疾病狀態下表達miRNA的細胞類型及miRNA在該細胞中的表達豐度變化，有助于更全面地認識疾病的發病機制。在DN中，miRNA作為TGF-β1重要的下游因子，通過沉默靶基因的轉錄后翻譯水平參與DN的發生、發展。隨著人們對miRNA研究的不斷深入，有助于更清晰地了解DN的發病機制，為DN的治療提供更有效的方法。

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The Research Progress of TGF-β1-Induced miRNAs in the Pathogenesis of Diabetic NephropathyWANGGou-qin，ZHOUXiao-chun，WANGJian-qin.(DepartmentofNephropathy，theSecondHospitalofLanzhouUniversity，Lanzhou730000，China)

Abstract：Diabetic nephropathy(DN) is a major micro vascular complication of diabetes.Due to the lack of effective treatments for diabetic kidney disease,the treatment mainly relies on drugs that either delays its progression or involves renal replacement therapies,such as dialysis and kidney transplantation.It is urgent to search for biomarkers for early diagnosis and effective therapy to improve the prognosis of DN.MicroRNAs have been shown to play fundamental roles in diverse biological and pathological processes,including cell proliferation,differentiation,apoptosis and carcinogenesis.Recently，the role of microRNAs in the pathogenesis of DN has been extensively discovered,and many transforming growth factor β1induced microRNAs are involved in the pathogenesis of DN.

Key words：Diabetic nephropathy； MicroRNAs； Transforming growth factor-β1； Pathogenesis

收稿日期：2014-10-30修回日期：2015-01-16編輯：鄭雪

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.19.034

中圖分類號：R587.2

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)19-3548-03