ClC2 調節中樞神經系統發育及其機制的研究進展

赫飛翔 葛子路 楊 志 李紅麗

氯離子通道是分布于細胞膜或細胞器膜上的一類能夠轉運氯離子及其他陰離子的通道蛋白，它是機體內最重要、最豐富的陰離子通道［1］。氯離子通道在多種生物進程中發揮重要作用，如細胞周期和細胞凋亡的調節、細胞體積的調節、突觸的傳遞和細胞興奮性的調節等［2～6］。電壓門控型氯離子通道(voltage-gated Cl-channel ，ClC)是氯離子通道的一種，也是目前在原、真核生物中研究得較為深入的一類氯離子通道。

一、ClC 的結構特性和分類

從細菌到人類的所有的生物體中均能找到ClC的同源體，例如大腸桿菌、釀酒酵母中均有ClC 的存在［7］。細菌ClC 蛋白的三維晶體結構模型顯示ClC蛋白的跨膜區由A ～R 共18 個傾斜排布在細胞膜上的α-螺旋組成［8］。對大腸桿菌ClC(EcClC)結構的研究表明，EcClC 由兩個完全相同的亞基組成一個近似菱形的復合體，其長軸10nm、短軸5.5nm，每個亞基的形狀近似三角形，兩個亞基反向平行排列，并且成軸對稱關系［9］。EcClC 的主體完全嵌合在脂質雙分子層內，只有N 端和C 端伸入胞質內。EcClC 的兩個通道位于每一個亞基的中心，形成雙管型的通道結構。兩個通道相互獨立，具有不同的電壓依賴性，兩個通道的開啟互不干涉，但通道的關閉卻受同一閘門控制［1］。整個ClC 家族蛋白的跨膜區結構基本相似［7］。

首先被發現的是存在于電鰩電器官中的ClC0，而在哺乳動物中第1 個被克隆出來的是ClC1。目前哺乳動物的ClC 共有9 種，依據同源性可將ClC 家族分為3 類:第1 類包括ClC0、ClC1、ClC2，這類ClC 主要在質膜上發揮作用;第2 類包括ClC3、ClC4 和ClC5，這類ClC 主要在胞內細胞器膜上發揮作用;第3 類包括ClC6、ClC7，與第2 類相似主要在細胞器膜上發揮作用。不同類型的ClC 發揮不同的功能，如ClC1 的功能主要在于穩定骨骼肌細胞膜電壓，而溶酶體ClC7 的破壞會導致骨質疏松癥和溶酶體貯積病［7，10］。由于ClC2 在細胞質膜上分布的特性和其在神經系統研究中領域所受的高關注度，本文主要探討ClC2 在神經發育中的作用。

編碼ClC2 的mRNA 存在于幾乎所有的細胞和組織中，其中以腦和上皮組織中分布最多［11］，在腦中，ClC2 在海馬的錐體細胞和小腦的浦肯野細胞內高度表達，還存在于神經膠質細胞中［8］。細胞膜上的負電位增大、細胞體積增大、細胞內離子濃度增高、輕度細胞外酸化環境等均能激活ClC2［11］。小鼠體內ClC2 受損可導致睪丸和視網膜的變性退化，這與生殖細胞和光感受器分別依賴支持細胞和視網膜色素上皮細胞(RPE)介導的跨膜轉運，而ClC2 的損壞使轉運受阻進而破壞了生殖細胞和光感受器內的離子平衡有關［3，4］。

二、ClC2 參與調控神經元興奮性

中樞神經系統中，神經元的主要功能是傳遞信息，神經元之間或神經元與效應細胞之間的信息傳遞主要通過突觸進行。ClC2 能夠調節γ -氨基丁酸A(γ-aminobutyric acid，GABAA)受體介導的神經元中的氯離子濃度［12，13］。位于突觸后膜上的GABAA受體是配體門控的氯離子通道，根據GABAA受體的分布和激活后的電生理特性，可以將GABAA受體分成兩大類:突觸性GABAA受體和突觸外GABAA受體，前者介導GABA 能神經元的時相性抑制，后者則介導GABA 能神經元的的緊張性抑制。GABAA受體的內源性配體GABA 是一種天然存在的非蛋白質氨基酸，是哺乳動物腦內最重要的抑制性神經遞質，腦內約30%左右的突觸以GABA 為神經遞質，腦內廣泛存在GABA 能神經元，主要分布在大腦皮質、海馬和小腦。由于細胞外的氯離子濃度遠大于細胞內，GABA 和GABAA受體結合激活受體使氯通道開放，氯離子順濃度梯度進入細胞膜內，膜內負電位增大產生超極化，使神經元的興奮性下降，產生中樞抑制效應。但是如果氯離子在短時間內不能有效排出細胞外，以保持細胞內的低氯環境，反復激活GABAA受體則會引起細胞內氯離子超載，后者可增加氯離子內流的阻力，使突觸后抑制作用明顯減弱。

生理狀態下，只有HCO-3和Cl-能通過GABAA受體在胞內外流動，通常情況下細胞外這些離子的濃度均保持在恒定水平，并且HCO-3是調節細胞內PH的主要離子，其細胞內的濃度與細胞外濃度基本相同。因此細胞內Cl-的濃度對GABAA能神經元的活性至關重要。與配體門控的氯離子通道介導氯離子內流不同的是，ClC2 是細胞膜上的內向整流氯通道，當細胞膜電位低于氯離子的平衡電位時，激活ClC2引起氯離子外流［12］。對大鼠脊髓背根神經節上的ClC2 研究表明，處于激活狀態的GABAA受體將細胞外的氯離子轉運入細胞內，ClC2 能夠及時有效的將這些氯離子排出細胞外，避免氯離子在細胞內大量堆積。ClC2 的這種特性不但能維持氯離子的平衡電位在膜靜息電位周圍波動，還能避免神經元的興奮性長時間過低，及時恢復神經元的興奮性［13］。

ClC2 的這種特性在防止顳葉性癲癇的發作中發揮重要作用。顳葉癲癇是大腦顳葉皮質錐體細胞異常放電所引起的嚴重臨床病變。在顳葉性癲癇發作時，成熟神經元中主要的氯離子轉運體(KCC2)活性明顯下降，氯離子不能及時從細胞內轉入細胞外，引起細胞內氯超載，降低GABA 能神經元的抑制作用，使腦內興奮-抑制作用失衡導致顳葉性癲癇的發生。最近的研究認為，成年動物的海馬CA 區，GABA 能神經元的緊張性抑制主要由GABAA受體的α5 亞基介導，癲癇發作時，這種緊張性抑制作用明顯減弱。有研究發現，癲癇發作時，大鼠CA1 區錐體細胞膜上ClC2 的活性上調，而特異性阻斷GABAA受體的α5亞基之后，由于ClC2 的內向整流特性，大鼠CA1 區錐體細胞膜上ClC2 的活性下降［14］。表明在癲癇發作時機體能通過上調神經元ClC2 活性，及時恢復神經元的抑制作用，并且ClC2 的這種作用與GABAA受體的α5 亞基的活性密切相關。

三、ClC2 參與調節神經膠質細胞水電解質平衡

神經膠質細胞對神經元的正常活動和物質代謝起重要作用。同時大腦和小腦發育中細胞構筑的形成都需要神經膠質細胞提供原初的框架結構，神經軸突再生也必須有膠質細胞的導引才能成功。作為細胞內最豐富的陰離子，氯離子在細胞膜電位調控和維持神經膠質細胞內水電解質平衡方面所發揮的重要作用逐漸凸顯。ClC2 基因缺陷小鼠的腦和脊髓白質中的神經膠質附近會形成廣泛的進行性海綿狀空泡，這種空泡和巨頭白質腦病伴皮質下囊腫(megalencephalic leukoencephalopathy with subcortical cysts，MLC)患者腦內出現的空泡形狀和位置均非常相似［11，15］。MLC 是腦白質營養不良的一種，患者常表現為一歲時出現畸形巨頭，腦白質隆起及皮質下出現囊腫等。放射性檢查顯示患者大腦含水量較正常人增加，對患者的腦組織進行活檢發現星形膠質細胞內有空泡存在［16］。腦組織中空泡的產生往往與細胞膜表面的離子運輸功能受損有關，因為離子運輸受損會導致細胞滲透壓的失衡并對細胞內穩態造成一定的干擾［5，17～19］，進而影響中樞神經系統的正常發育。而ClC2 則被證實參與維持腦白質內的水和電解質的平衡。

腦白質主要由有髓鞘的軸突構成，這些軸突最重要的生理功能是傳導沖動。動作電位的產生依賴于細胞膜內外水和電解質的平衡，而腦白質內的星形膠質細胞則是維持腦內水和電解質平衡最重要的細胞［16］，他們在腦白質內大量分布且互相之間聯系密切。同時在腦白質內存在一個“盤狀神經膠質”的合胞體，它是由星形膠質細胞、少突膠質細胞和室管膜細胞通過縫隙連接組成的巨大網絡［20］。這個巨大的合胞體在腦白質內的長距離水、電解質運輸中發揮重要作用。在過去的認識中，K+一直被認為是星形膠質細胞中調節神經興奮性的重要離子，鉀離子通道Kir4.1 在其中發揮重要作用。后來的研究發現ClC2和Kir4.1 都存在于少突膠質細胞和星形膠質細胞中，由于ClC2 轉運Cl-和的特性，ClC2 被認為在調節少突膠質細胞和星形膠質細胞之間縫隙內的離子平衡和酸堿平衡中起重要作用。

近年來證實MLC 的發病與基因表達有關，它是第1 個被人們所知的由基因缺陷引起腦星形膠質細胞調節水電解質平衡紊亂的疾病［20］。MLC1 和神經膠質細胞黏附分子編碼基因(GlialCAM)是導致MLC發病的兩個致病基因，其中75%的MLC 患者是由于MLC1 基因缺陷導致［11］。GlialCAM 作為MLC1 的亞基，兩者都存在于軸突和星形膠質細胞間的局部連接中，敲除星形膠質細胞中的MLC1 導致GlialCAM 和ClC2 的表達受抑制，而與MLC1 不同的是，GlialCAM還存在于中樞神經系統的髓鞘內［11，15］。GlialCAM 同時也是分布在神經膠質細胞上的ClC2 的輔助性亞基，因此，GlialCAM 的異常很可能引起ClC2 功能的異常，進而破壞中樞神經系統的正常功能。但是在隨后的研究中卻發現CLCN2(編碼ClC2 的基因)基因敲除的小鼠腦組織中雖然產生了水腫樣空泡，卻沒有引起明顯的神經系統病理和功能改變，使ClC2 在MLC 的發生中所起的作用受到懷疑［11］。GlialCAM基因缺陷的MLC 患者腦內MLC1 和ClC2 表達均受到影響，但是MLC1 基因缺陷導致的MLC 患者的臨床癥狀較GlialCAM 基因缺陷嚴重，具體的機制至今不明，這其中是否有ClC2 的參與仍然值得進一步研究。而Depienne 等［20］卻認為CLCN2 基因突變所導致的是一種新形式的MLC，在人群中以常染色體隱性遺傳方式存在，發生率較傳統MLC 低。在白質腦病數據庫中篩選符合要求的7 例患者，其中對照組為3 例成年發病型白質腦病患者和1 例小腦共濟失調X 連鎖隱形遺傳患者，實驗組為3 例幼年發病型白質腦病且CLCN2 基因突變患者，通過MRI 檢查患者腦部病變情況。通過對患者CLCN2 基因測序發現p. Leu144_Ile145del 和p.Ala500Val 的突變導致ClC2跨膜區的疏水性氨基酸表達異常，進而影響ClC2 的功能。實驗結果表明實驗組腦髓鞘內確實存在進行性空泡，ClC2 是維持星形膠質細胞內水電解質平衡的重要部分，證實了ClC2 在維持神經膠質細胞水電解質平衡中的重要作用。

四、ClC2 過度活化促進神經細胞凋亡

細胞凋亡是細胞的一種基本生物學現象，在多細胞生物去除不需要的或異常的細胞中起重要的作用，生理性的細胞凋亡是維持體內細胞數量動態平衡的基本措施，病理性的細胞凋亡則會對機體的發育和正常功能造成損害。在早期胚胎發育過程中，神經系統的發育起源于外胚層，在神經胚形成早期，神經管神經上皮中存在著大量具有定向分化能力的神經干細胞，乙醇、高濃度葡萄糖和咖啡因等均能對細胞的發育環境造成影響，任何原因引起神經干細胞的早期凋亡均可影響神經管的正常發育，對胚胎神經系統的發育影響極大。妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指在妊娠期發生或首次發現的不同程度的糖耐量異常，包括在妊娠前已存在但未被診斷的糖耐量異常或糖尿病。有研究指出GDM 能引起神經干細胞的過度凋亡進而影響神經管的發育并引發神經管缺陷(neural tube defects，NTDs)。

近年來的研究發現，氯離子在細胞凋亡中發揮的作用日益凸顯。在對大鼠腦皮質神經元凋亡的研究中發現氯離子的過度外流是導致神經元凋亡的主要原因。在腫瘤壞死因子介導的大鼠肝細胞凋亡實驗中，凋亡肝細胞中的氯電流是正常肝細胞的5 倍，提示氯離子的過度外流在細胞凋亡中發揮重要作用。

細胞凋亡的原因和可能的機制層出不窮。大多數情況下來自細胞外的凋亡誘導因素作用于細胞后可轉化為細胞凋亡信號，并通過胞內不同信號轉導途徑，激活細胞死亡途徑，最終導致細胞凋亡。目前研究較多的與細胞凋亡相關的信號轉導系統主要有:PI3K-Akt 信號系統、cAMP/PKA 信號系統、PTK 信號系統等。有研究表明PI3K -Akt 信號通路和氯離子通道間關系緊密，Junshan 等對從蟾毒中提取出的一種新型氯通道激活劑——蟾蜍二烯羥酸內酯的研究中發現，氯離子通道的過度活化，能抑制PI3K -Akt 通路的表達，促使腫瘤細胞的凋亡，達到抗腫瘤的效果。

4，4 -二異硫氰基芪-2，2' -二磺酸(4，4' -Diisothiocyanostilbene -2，2' - disulfonic acid，DIDS)是ClC2 的非特異性阻斷劑，在神經系統的研究實驗中已證實DIDS 阻斷氯離子通道后可以抑制大鼠小膠質細胞的過度活化，使細胞保持正常的容積和生理功能。研究發現，DIDS 能夠激活PI3K -Akt 通路抑制心肌細胞凋亡，減輕缺血/再灌注對心肌組織的損傷，提示氯離子通道的過度活化導致細胞的凋亡的發生，且這一過程很可能通過抑制PI3K -Akt 的表達實現的。同時Ho 等發現在高糖誘導血管內皮細胞凋亡過程中，PI3K - Akt 通路的磷酸化起到抑制細胞凋亡，保護血管內皮的作用也提示PI3K -Akt 通路在高糖誘導細胞凋亡途徑中發揮重要作用。

PI3K-Akt 信號途徑是一條經典的信號途徑，參與細胞凋亡的調控，并且主要表現為抑制細胞凋亡，可能與下面幾種機制有關:①PI3K -Akt 通過抑制天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族成員的活化，抑制caspase 導致細胞凋亡;②調節bcl -2 家族成員的活性，PI3K-Akt 的激活可以使bcl-2 家族中的促凋亡蛋白Bad 的Ser136/Ser112 殘基磷酸化，磷酸化的Bad 與抑制細胞凋亡蛋白bcl -2 或bcl -xL 解聚，使bcl-2 發揮抗凋亡作用;③抑制促凋亡基因FasL 的表達，活化的Akt 能夠磷酸化FKHR 蛋白，抑制FKHR 進入細胞核誘導的FasL 表達，從而抑制細胞凋亡;④轉錄因子NF -κB 活化進入細胞核，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡等。

目前已經證實母體妊娠糖尿病是導致新生兒畸形的重要因素，其引起新生兒畸形的概率高達6% ～10%，其誘發的器官缺陷累及神經系統、心血管系統、消化系統、泌尿生殖系統等，在諸多畸形中以神經管缺陷最為常見。而目前妊娠糖尿病導致神經干細胞凋亡的具體機制仍不清楚，使母體妊娠糖尿病致胎兒神經管缺陷在臨床治療上仍存在很大難度。因此，探究氯離子通道在妊娠糖尿病導致神經管缺陷中的作用將進一步推動對妊娠糖尿病導致神經管缺陷生理及病理全過程的了解。

ClC2 廣泛存在于神經系統中，它在神經細胞凋亡過程中發揮的作用不可忽視。但目前ClC2 過度活化和神經細胞凋亡關系的文獻報道尚少，有研究指出在缺血缺氧性腦損傷中，ClC2 的過度活化導致了少突膠質細胞的凋亡，而氯離子通道阻斷劑DIDS 能在這一損傷中有效保護少突膠質細胞，這一發現無疑對ClC2 的活性影響神經系統發育具有重要意義。

五、展 望

氯離子是機體內最重要、最豐富的陰離子，2 型電壓門控氯離子通道(ClC2)作為眾多氯離子通道的一種，是目前研究的熱點，也是目前研究較為深入的一種電壓門控通道。其在調節神經系統的興奮性、參與神經組織發育中發揮重要作用，而ClC2 的過度活化可能通過抑制PI3K -Akt 通路的磷酸化促進神經細胞的凋亡。神經系統作為機體中起主導作用的系統，調節神經元的興奮性至關重要。關于CLCN2 基因的缺陷是否是導致腦白質營養不良的原因之一，雖然目前仍存在爭議，但ClC2 對神經組織的保護作用越來越引起人們重視。ClC2 的過度開放是否是母體妊娠糖尿病導致胚胎神經管缺陷機制中的一個環節，值得進一步深入研究，毫無疑問，高糖環境下抑制神經干細胞的早期凋亡，對確保胎兒神經管的正常發育具有非常重要的意義。目前ClC2 在神經系統發育過程中的作用的具體機制仍有很多不清楚之處，對這一領域的研究仍需付出更多的努力。

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