微RNA在骨肉瘤中的研究進展

單　喆，胡兆華,田青松(綜述)，盛德喬，李新志(審校)

(三峽大學醫學院 三峽大學分子生物學研究所，湖北 宜昌 443002)

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微RNA在骨肉瘤中的研究進展

單喆△，胡兆華,田青松(綜述)，盛德喬※，李新志(審校)

(三峽大學醫學院 三峽大學分子生物學研究所，湖北 宜昌 443002)

摘要：微RNA(miRNA)是一類長度為21～23個核苷酸的調控性小RNA分子，通過mRNA剪切和抑制蛋白質翻譯兩種方式，負性調控其靶基因。miRNA可以調控約50%的蛋白編碼基因，并且參與了包括細胞分化、細胞凋亡等在內的多種生理過程。近年來發現，miRNA在腫瘤相關方面發揮重要作用。該文從miRNA在骨肉瘤中的發生發展、侵襲轉移、與藥物的協同作用及在血液循環當中的應用4個方面予以綜述，并對miRNA在骨肉瘤方面的前景進行展望。

關鍵詞：骨肉瘤；微RNA；血液循環

骨肉瘤是一種惡性腫瘤，由于其發生遠處轉移早，對化療不反應敏感，患者的5年生存率僅為50%～60%，因此改良現有治療手段，探索新的治療方法迫在眉睫[1]。近年來，微RNA(microRNA,miRNA)在腫瘤發生、發展中的作用及用于抗腫瘤治療的研究已成為熱點。越來越多的研究表明，miRNA在骨肉瘤腫瘤的發生、發展、侵襲、轉移等方面發揮了重要的調節作用[2-3]。Gougelet等[4]通過miRNA芯片分析確定了5種miRNA可作為有轉移骨肉瘤的診斷指標。現就miRNA在骨肉瘤中的研究進展予以綜述。

1miRNA的產生及作用

miRNA是一類可在轉錄后水平調控基因表達的非編碼RNA分子，成熟的miRNA是長度為21～22個核苷酸的單鏈RNA分子。miRNA基因在細胞核內完成轉錄，初級轉錄物裂解成前體分子與一個不完美的莖環結構，前體分子通過輸出蛋白5由細胞核轉移到細胞質。在細胞質中，前體分子被Dicer裂解為雙鏈RNA分子。所形成的miRNA在蛋白復合體/RNA誘導的沉默復合物作用下，可與成熟信使RNA上任意與之互補的序列結合，從而抑制基因轉錄和(或)使信使RNA降解而抑制基因表達。miRNA僅與其靶基因3′端非翻譯區的特殊位點結合抑制其翻譯過程，從而調控基因表達[5-7]。miRNA參與了生物體很多重要的生理功能，其異常表達與腫瘤的發生、發展及侵襲轉移密切相關。

2miRNA與骨肉瘤

2.1miRNA與骨肉瘤的發生、發展骨肉瘤的發病機制目前還不清楚，miRNA與腫瘤發生的相關研究為骨肉瘤發病機制的研究提供了新的思路。miR-128根據細胞環境的不同可在不同的腫瘤中發揮致癌基因或抑癌基因的作用[8-11]。Shen等[12]研究發現，與鄰近正常組織相比，miR-128在骨肉瘤組織中的表達顯著升高；在骨肉瘤細胞系U20S和MG63中，miR-128的過表達可有效促進被反義miR-128抑制的細胞增殖。進一步的研究還發現，miR-128在人骨肉瘤增殖過程中發揮重要作用是通過直接調節蛋白酪氨酸磷酸酶基因/蛋白激酶B信號途徑實現的，提示miR-128可能為骨肉瘤的致癌基因，通過抑制其表達可為骨肉瘤的治療提供新思路。miR-145已被證實在多種腫瘤細胞中呈低表達，而且miR-145作為一種抑癌基因可影響腫瘤細胞的生長。Tang等[13]選取166組骨肉瘤組織及其周圍無腫瘤骨組織，通過實時定量聚合酶鏈反應方法檢測miR-145的表達水平，結果顯示，與周圍無腫瘤骨組織相比，骨肉瘤組織中miR-145表達顯著下降。該研究小組將166組標本根據miR-145表達的高低分為兩組，統計學分析結果顯示：miR-145低表達的患者臨床分期處于晚期且多伴有遠處轉移，且總體生存期和無疾病進展生存期更短；而miR-145高表達的患者多處于臨床早期，腫瘤細胞更小，無遠處轉移，對化療反應更好，且總體生存期和無疾病進展生存期更長。多變量分析證明，miR-145的低表達是影響預后的一個獨立因素。這也是第一次有確切的證據顯示miR-145的低表達與腫瘤的侵襲和遠處轉移相關，miR-145可能成為判斷骨肉瘤預后的一個獨立的標志物。

miR-34a被發現在骨肉瘤組織及MG-63和SAOS-2細胞系中表達降低，上調其表達可抑制骨肉瘤細胞的增殖[14]。異種移植裸鼠模型的結果顯示，轉染miR-34a組的裸鼠的腫瘤細胞體積顯著小于對照組，證明miR-34a可在活體內發揮腫瘤抑制作用。為探索miR-34a抑制腫瘤生長的機制，該研究小組做了進一步的研究，發現與對照組相比，轉染miR-34a組鉀離子通道的表達水平顯著降低，提示腫瘤抑制劑miR-34a的活性是通過負性調節致癌基因蛋白Eag1介導的[14]。Eag1在腫瘤的發展過程中起重要作用，在活體內及活體外抑制其表達均可抑制骨肉瘤的生長[15-17]。研究顯示，Eag1的表達在人類神經母細胞瘤細胞中可通過p53-miR-34-E2F1途徑由p53負性調節[18]。抑制Eag1的表達可顯著減少腫瘤細胞的增殖，或使其成為骨肉瘤基因治療潛在的靶點。

2.2miRNA與骨肉瘤的侵襲轉移越來越多的證據表明，miRNA不僅參與了骨肉瘤的發生、發展，還與骨肉瘤的侵襲轉移有關。Wang等[19]研究發現，骨肉瘤組織和細胞系中miR-335的表達遠遠低于正常組織，其表達的下調與淋巴轉移顯著相關。將miR-335轉染入MG-63和U2OS可抑制骨肉瘤細胞的侵襲和轉移。而且，miR-335可通過結合其3′端非翻譯區靶位點，在轉錄后水平負性調節鋅離子相關的RhoA蛋白1基因的表達。ROCK1在很多腫瘤中表達升高，并引起不良預后，其在骨肉瘤組織中的表達與miR-335的表達呈負相關，用干擾小RNA使ROCK1表達下調可抑制骨肉瘤細胞的侵襲和轉移，類似于提高miR-335的表達。提示miR-335可能為腫瘤抑制劑，而ROCK1是一潛在的骨肉瘤治療靶點。另有研究發現，miR-340在骨肉瘤組織和骨肉瘤細胞系中表達常常是下調的，在骨肉瘤細胞系中使miR-340過表達可顯著抑制在體外細胞增殖、遷移和侵襲，在異種移植小鼠模型中抑制腫瘤的生長和轉移[20]。ROCK1也是miR-340的靶基因，miR-340過表達可下調ROCK1的表達，表明miR-340可作為腫瘤抑制因子，其在腫瘤組織中的表達下調有助于骨肉瘤的進展和轉移。因此，miR-340可能成為骨肉瘤診斷和治療的靶標。

最近的研究還發現，miR-218在人骨肉瘤組織和骨肉瘤細胞系SAOS-2細胞中低表達，miR-218表達載體轉染后發現，SAOS-2細胞增殖被顯著抑制，接著用劃痕試驗分析發現，與對照組相比，轉染miR-218的SAOS-2細胞侵襲和轉移能力也被顯著抑制[21]。miR-218有3個潛在的靶基因，即T細胞淋巴瘤侵襲轉移誘因子1、基質金屬蛋白酶2和基質金屬蛋白酶9，miR-218表達可抑制其潛在靶基因的表達。

Wang等[22]報道，與無癌變的骨組織相比，骨肉瘤組織中的miR-214水平顯著提高，高表達的miR-214通常容易引起巨大腫瘤、遠處轉移及對化療不敏感。高表達的miR-214與總體生存期及無疾病進展生存期的縮短有很大聯系，多元統計分析證實，miR-214的高表達是愈后生存期縮短的獨立因素。

2.3miRNA可增加表柔比星的抗骨肉瘤效應表柔比星廣泛用于骨肉瘤的化療。經過表柔比星處理的骨肉瘤細胞約有40種miRNA表達發生改變，包括在骨肉瘤細胞中表達下調的24種miRNA，而其中低表達的miR-302b，則有可能被表柔比星誘導。Zhang等[23]用不同濃度的表柔比星處理MG-63和SAOS-2細胞24 h，發現表柔比星抑制骨肉瘤細胞增殖呈劑量依賴性，濃度為1×10-3μg/L的表柔比星可顯著抑制骨肉瘤細胞的增殖。在用芯片技術檢測的1146種miRNA中，43種成熟miRNA的表達受到顯著的影響，與成骨細胞相比，骨肉瘤細胞中的miR-302b水平顯著降低，而1×10-3μg/L的表柔比星可顯著提高miR-302b在MG-63和SAOS-2細胞中的表達水平。將miR-302b轉染到骨肉瘤細胞中發現，與對照組相比，轉染了miR-302b的骨肉瘤細胞生長受到顯著抑制，表明miR-302b過表達可增強表柔比星的抗骨肉瘤效應。細胞周期分析結果顯示，miR-302b可誘導骨肉瘤細胞周期阻滯，這種阻滯是通過下調細胞周期蛋白D1和細胞周期素依賴性激酶2/4表達實現的。miR-302b還可誘導骨肉瘤細胞的凋亡，其是通過激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3及調節磷酸化的AKT、蛋白激酶B和抗凋亡蛋白Bcl-2等凋亡相關蛋白的表達實現的。用表柔比星治療也可產生類似效果，但miR-302b的抗骨肉瘤效應并不依賴于表柔比星，miR-302b可增強表柔比星的抗骨肉瘤效應，這為骨肉瘤的治療開辟了新的思路。

3血液循環中miRNA可用于骨肉瘤的早期診斷

miRNA與腫瘤的發生、發展及侵襲轉移密切相關，最近研究還發現miRNA出現在血液循環中，使其作為腫瘤的生物標志物成為可能[24]。miR-34家族成員(miR-34a、miR-34b和miR-34c)通過參與p53驅動的細胞凋亡和細胞周期阻滯發揮腫瘤抑制作用[25-27]。Tian等[28]在研究血漿miR-34b/c表達水平和骨肉瘤之間的關系時發現，與健康人群相比，骨肉瘤患者血漿中miR-34b的水平顯著降低，而miR-34c水平與骨肉瘤的發生無顯著關系，提示miR-34b可能與骨肉瘤的發生、發展聯系密切，其作用或為抑癌基因。進一步分析骨肉瘤組織樣本miR-34b表達水平，發現與周圍正常組織相比，骨肉瘤組織中miR-34b表達水平較低，證實miR-34b在血漿的表達水平與其在病理組織中的表達水平顯著相關。從骨肉瘤臨床表現分析，有遠處轉移的患者血漿中miR-34b的表達水平比無遠處轉移患者顯著降低，提示miR-34b在血漿中的表達水平與腫瘤的轉移狀態顯著相關，為早期治療骨肉瘤及預測遠處轉移方面提供新的思路。

6種miRNA(miR-21、miR-199-3p、miR-143、miR-34、miR-140及miR-132)在骨肉瘤的發生中起調節作用。Ouyang等[29]取40例骨肉瘤患者及相同數量健康對照者的血漿，用實時定量聚合酶鏈反應技術測定其miRNA的表達水平，發現miR-21在血液循環中的水平顯著升高，而miR-199a-3p和miR-143的水平顯著下降。受試者工作特征、工作曲線分析血液循環中骨特異的堿性磷酸酶和miRNA發現，與骨特異的堿性磷酸酶相比，miRNA在骨肉瘤的診斷中是一個更為敏感的指標。在分析80例樣本血液循環中的miRNA水平與臨床表現的關系時發現，與無遠處轉移的患者相比，有遠處轉移患者的miR-21水平顯著上升，而miR-143的水平顯著下降；組織學分析發現，與非成骨細胞型的患者相比，成骨細胞型患者血液循環中miR-21的水平更高，而miR-199a-3和miR-143的水平顯著下降[29]，這些發現為骨肉瘤的早期診斷、判斷組織學亞型及是否有轉移風險等方面提供了新的方法和途徑。

4問題與展望

近年來腫瘤的診斷標準發生了重大的變化，從純粹基于形態學到現在納入了免疫學、細胞遺傳學和分子生物學方面的應用。雖然眾多的研究結果已經證實，miRNA參與骨肉瘤的發生和發展、侵襲和轉移，但具體的分子機制仍然需要進一步的研究。由于miRNA的基因靶向治療有望極大程度地改善骨肉瘤患者的預后，未來可研究以miRNA為基礎的輸送效率高、治療效果好且安全系數高的動物模型實驗。

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Progress in Research on MicroRNA in Ostersarcoma

SHANZhe,HUZhao-hua,TIANQing-song,SHENGDe-qiao,LIXin-zhi.

(InstituteofMolecularBiology，MedicalScienceCollegeofChinaThreeGorgesUniversity,Yichang443002，China)

Abstract：MicroRNAs(miRNAs) are a class of regulatory small RNA moleculars of about 21-23 nucleotide in length，which negatively regulate target gene by mRNA splicing and inhibition of protein translation.miRNAs can regulate about 50% of the protein-coding genes，and participate in a variety of physiological processes including cell differentiation and apoptosis.Recent studies have shown that miRNAs are involved in tumor development and are closely associated with the initiation，progression，invasion and metastasis of human osteosarcoma as oncogenes or tumor suppressor genes.Here is to discuss the roles of miRNAs in osteosarcoma from the perspectives of osteosarcoma genesis and development,invasion and metastasis,synergy with medication and their roles in blood circulation,and the future of the field is also prospected.

Key words：Osteosarcoma; MicroRNA; Blood circulation

收稿日期：2014-01-24修回日期：2014-05-27編輯：鮑淑芳

基金項目：國家自然科學基金(81172788)；湖北省高等學校優秀中青年科技創新團隊計劃項目(T201203)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.01.018

中圖分類號：R68

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)01-0045-03