樹(shù)脂對(duì)普洱茶多糖的純化與分離

楊新河，黃建安，劉仲華,*，毛清黎

（1.湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 孝感 432000；2.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

樹(shù)脂對(duì)普洱茶多糖的純化與分離

楊新河1,2，黃建安2，劉仲華1,2,*，毛清黎1,2

（1.湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 孝感 432000；2.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

研究10 種樹(shù)脂對(duì)普洱茶多糖脫色和蛋白質(zhì)去除的效果及DEAE-52纖維素離子交換樹(shù)脂對(duì)普洱茶多糖的分離效果。結(jié)果表明，D101樹(shù)脂適合于對(duì)普洱茶多糖同時(shí)脫色和蛋白質(zhì)去除，當(dāng)普洱茶多糖溶液體積為50 mL時(shí)，在pH 4、溫度50 ℃、料液質(zhì)量濃度3.8 mg/mL、樹(shù)脂用量11 mL的條件下，普洱茶 多糖的脫色率為82.33%、蛋白質(zhì)去除率為70.89%。DEAE-52纖維素離子交換樹(shù)脂分離經(jīng)D101樹(shù)脂處理的普 洱茶多糖能得到6 個(gè)不同多糖級(jí)分。

樹(shù)脂；普洱茶；多糖；純化；分離

普洱茶是以云南省一定區(qū)域內(nèi)的云南大葉種曬青毛茶為原料，經(jīng)過(guò)后發(fā)酵加工成的散茶和緊壓茶。研究表明，普洱茶具有抗氧化、降血脂、降血糖、抗突變、防癌等功能[1-7]，而茶多糖是其藥理作用的主要成分之一[8-13]。目前，普洱茶多糖的研究?jī)H停留在粗茶多糖層面，幾乎不能確定其結(jié)構(gòu)特征和評(píng)價(jià)其確切功效，因而開(kāi)展普洱茶多糖的分離對(duì)深入進(jìn)行普洱茶多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性研究具有極其重要的意義。

目前，茶多糖的分離研究涉及到脫色、蛋白質(zhì)去除和分級(jí)等方面。常用的多糖脫色方法有活性炭法、過(guò)氧化氫法和十六烷基三甲基溴化銨-正己醇-異辛烷法；蛋白質(zhì)去除技術(shù)有鹽析法、等電點(diǎn)沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法和酶解法[14]；常見(jiàn)的分級(jí)方法有沉淀法、超濾法和柱層析法[15-18]。其中脫色和蛋白質(zhì)去除的上述方法均存在一些不足，如引起多糖的降解與結(jié)構(gòu)破壞、有機(jī)溶劑殘留及效率低等，并且脫色和蛋白質(zhì)去除分為兩步進(jìn)行時(shí)工序繁鎖、多糖損失嚴(yán)重。而大孔吸附樹(shù)脂是一類有機(jī)高聚物吸附劑，具有良好的大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和較大的比表面積，主要應(yīng)用于環(huán)保、醫(yī)藥工業(yè)、化學(xué)工業(yè)、食品工業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域。其中，大孔樹(shù)脂已用于多種植物多糖脫色[19-23]，但大孔樹(shù)脂同時(shí)脫除粗多糖中的色素和蛋白質(zhì)的研究很少報(bào)道。本研 究探討大孔樹(shù)脂對(duì)普洱茶多糖脫色和蛋白質(zhì)去除的效果，并采用兼有脫色功能的DEAE-52纖維素離子交換樹(shù)脂對(duì)普洱茶多糖進(jìn)行分級(jí)，旨在為研究普洱茶多糖的結(jié)構(gòu)與生物活性奠定基礎(chǔ)，也為研究其他富含多酚類化合物的植物原料經(jīng)微生物發(fā)酵后提取的多糖脫色及蛋白質(zhì)去除提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍潤(rùn)普洱茶（2007年） 云南龍潤(rùn)茶業(yè)集團(tuán)；AB-8、S-8、NKA-9、D201×4及001×7樹(shù)脂 南開(kāi)大學(xué)化工廠；聚酰胺 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司；LSA-7樹(shù)脂 西安藍(lán)曉科技有限公司；D101樹(shù)脂 天津農(nóng)藥廠；XAD-7HP和HP-20樹(shù)脂 日本三菱樹(shù)脂株式會(huì)社；纖維素DEAE-52陰離子交換樹(shù)脂 英國(guó)Whatman公司；D32透析袋 美國(guó)Bromma公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3TC型酸度計(jì) 上海天達(dá)儀器有限公司；SKY-200B型恒溫培養(yǎng)震蕩器 上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；Rotavapor R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 瑞士Büchi公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；SHIMADZU UV-2550型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 日本島津公司；SMY-2000ST測(cè)色色差計(jì) 北京盛名揚(yáng)科技開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司；LD4-2A型低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；DHL-A電腦恒流泵、SZ-100自動(dòng)收集器 上海滬西儀器廠；玻璃層析柱 長(zhǎng)沙匯虹玻璃儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樹(shù)脂的預(yù)處理

工藝流程：陰（陽(yáng)）離子交換樹(shù)脂→95%乙醇浸泡12 h→蒸餾水洗至流出液在試管中用水稀釋不渾濁→4% NaOH溶液（5% HCl溶液）浸泡4 h→蒸餾水洗至中性→5% HCl溶液（4% NaOH溶液）浸泡4 h→蒸餾水洗至中性。

吸附樹(shù)脂的預(yù)處理與陽(yáng)離子交換樹(shù)脂相同。

1.3.2 樣品制備

稱取一定質(zhì)量經(jīng)石油醚脫脂的普洱茶干燥粉碎樣，放置浸提瓶中，加入25倍質(zhì)量的蒸餾水，在90 ℃水浴鍋中浸提70 min，過(guò)濾，濾液濃縮至一定體積，加入95%乙醇使最終醇體積分?jǐn)?shù)為80%，4 ℃冰箱中靜置12 h后以4 000 r/min離心10 min，取沉淀加適當(dāng)水溶解，真空濃縮至無(wú)醇味，備用。

1.3.3 靜態(tài)吸附操作方法

量取5 mL經(jīng)預(yù)處理的離子交換樹(shù)脂或吸附樹(shù)脂于250 mL三角瓶中，分別加入50 mL相同的普洱茶多糖溶液，30℃恒溫振搖24 h，振搖頻率120 r/min。振搖結(jié)束后，用濾紙過(guò)濾的方法將樹(shù)脂和茶多糖溶液分離，濾液定容至100 mL并調(diào)至與原多糖溶液相同的pH值，然后測(cè)定溶液與蒸餾水的總色差ΔE與蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，計(jì)算脫色率與蛋白質(zhì)去除率。

1.3.4 動(dòng)態(tài)吸附操作方法

取3 根玻璃層析柱，分別裝入經(jīng)預(yù)處理的D101、HP-20及AB-8樹(shù)脂70 mL，按照2 BV/h流速各加入與靜態(tài)吸附相同的茶多糖溶液280 mL，按照0.5 BV/管收集并測(cè)定每管溶液與蒸餾水的總色差ΔE*，按照式（1）計(jì)算動(dòng)態(tài)吸附率。上樣完畢，關(guān)閉柱子下端活塞0.5 h，接著用2 BV蒸餾水以2 BV/h的流速洗脫，合并水洗脫液與上樣收集的流出液，測(cè)定溶液與蒸餾水的總色差ΔE與蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，計(jì)算脫色率與蛋白質(zhì)去除率。

1.3.5 D101樹(shù)脂靜態(tài)吸附色素的曲線

量取5 mL經(jīng)預(yù)處理的D101樹(shù)脂于250 mL三角瓶中，加入50 mL普洱茶多糖溶液，恒溫振搖，振搖轉(zhuǎn)速120 r/min。每小時(shí)取1 mL溶液用于測(cè)定與蒸餾水的總色差ΔE，同時(shí)補(bǔ)充1 mL原液于三角瓶中，計(jì)算樹(shù)脂吸附不同時(shí)間的脫色率。

1.3.6 D101樹(shù)脂靜態(tài)吸附單因素試驗(yàn)

1.3.6.1 溫度對(duì)D101樹(shù)脂脫色和蛋白質(zhì)去除的影響量取5 份經(jīng)預(yù)處理的樹(shù)脂5 mL，各加入相同質(zhì)量濃度的茶多糖溶液50 mL，溫度分別設(shè)為20、30、40、50、60 ℃，恒溫振搖5 h，轉(zhuǎn)速120 r/min。振搖結(jié)束后，依照

1.3.3 節(jié)方法操作。

1.3.6.2 樹(shù)脂用量對(duì)D101樹(shù)脂脫色和蛋白質(zhì)去除的影響

分別量取經(jīng)預(yù)處理的樹(shù)脂3、5、7、9、11 mL，加入相同質(zhì)量濃度的多糖溶液50 mL，50℃振搖5 h，轉(zhuǎn)速120 r/min。振搖結(jié)束后，依照1.3.3節(jié)方法操作。

1.3.6.3 pH值對(duì)D101樹(shù)脂脫色和蛋白質(zhì)去除的影響

量取5 份經(jīng)預(yù)處理的樹(shù)脂7 mL，分別加入預(yù)先調(diào)節(jié)好pH值為4.0、4.6、5.2、5.8、6.4的相同質(zhì)量濃度的多糖溶液50 mL，50 ℃振搖5 h，轉(zhuǎn)速120 r/min。振搖結(jié)束后，依照1.3.3節(jié)方法操作。

1.3.6.4 料液質(zhì)量濃度對(duì)D101樹(shù)脂脫色和蛋白質(zhì)去除的影響

量取5 份經(jīng)預(yù)處理的樹(shù)脂7 mL，分別加入質(zhì)量濃度為0.24、0.48、0.95、1.90、3.80 mg/mL多糖及pH 5.2的溶液50 mL，50℃振搖5 h，轉(zhuǎn)速120 r/min。振搖結(jié)束后，依照1.3.3節(jié)方法操作。

1.3.7 D101樹(shù)脂靜態(tài)吸附正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定溫度、樹(shù)脂用量、pH值及料液質(zhì)量濃度四因素的水平見(jiàn)表1，進(jìn)行正交試驗(yàn)全面考察4 個(gè)因素對(duì)D101樹(shù)脂脫除普洱茶多糖溶液中色素和蛋白質(zhì)的影響，優(yōu)化參數(shù)。

表 1 D101樹(shù)脂靜態(tài)吸附因素水平表Table 1 Variables and levels used in orthogonal array design for static adsorption of D101 resin

1.3.8 分析及計(jì)算方法

1.3.8.1 蛋白質(zhì)測(cè)定及蛋白質(zhì)去除率計(jì)算

蛋白質(zhì)測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[24]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，線性回歸方程為ρ=231.35A—11.396，相關(guān)系數(shù)r=0.996 4，其中，ρ為以牛血清白蛋白計(jì)的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（μg/mL）；A為吸光度。

式中：ρ前、ρ后分別為脫色前和脫色后蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

1.3.8.2 色差值測(cè)定及脫色率計(jì)算[25]

調(diào)整待測(cè)茶多糖溶液pH值，用蒸餾水稀釋4倍，測(cè)定與蒸餾水的總色差ΔE。

式中：ΔE前、ΔE后分別為脫色前、后溶液與蒸餾水的總色差值。

1.3.9 DEAE-52柱層析分離普洱茶茶多糖

準(zhǔn)確稱取經(jīng)D101樹(shù)脂脫色和脫蛋白質(zhì)的多糖樣品2g，溶于20mL蒸餾水中，上DEAE-52柱（有效柱體積為120 mL），依次用1BV蒸餾水及0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 mol/L NaCl溶液洗脫，控制流速為0.1 BV/h，按照5 mL/管收集并測(cè)定每管在280 nm波長(zhǎng)處的吸光度，然后將樣品溶液按1∶5稀釋后用硫酸-苯酚法測(cè)定多糖的含量。以苯酚-硫酸法檢測(cè)280 nm波長(zhǎng)處多糖的吸光度為縱坐標(biāo)，以試管數(shù)目為橫坐標(biāo)作DEAE-52色譜柱洗脫曲線圖。分別合并各主峰溶液，減壓濃縮至一定體積后用流水透析48 h，然后減壓濃縮透析袋內(nèi)的多糖溶液，冷凍干燥得到多糖級(jí)分。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹(shù)脂的初步篩選

圖 1 樹(shù)脂靜態(tài)吸附對(duì)茶多糖脫色和蛋白質(zhì)去除的效果Fig.1 Effect of static adsorption by different types of resins on decolorization and deproteinization

由圖1可知，10 種樹(shù)脂對(duì)普洱茶多糖中色素和蛋白質(zhì)的吸附各不相同，其中D101、S-8、HP-20及AB-8樹(shù)脂對(duì)普洱茶多糖中色素和蛋白質(zhì)的吸附能力較強(qiáng)，均能去除普洱茶多糖中60%以上的色素和50%以上的蛋白質(zhì)，而其余6種樹(shù)脂的色素脫除率和蛋白質(zhì)去除率均低于50%。這10種樹(shù)脂對(duì)普洱茶多糖中色素和蛋白質(zhì)去除能力的差異受到樹(shù)脂的極性、比表面積、孔體積和平均孔徑、以及普洱茶多糖、蛋白質(zhì)和色素的相對(duì)分子質(zhì)量與極性等多重因素的綜合影響。圖1還表明，001×7陽(yáng)離子交換樹(shù)脂不但沒(méi)有脫色效果，反而使普洱茶多糖的顏色加深，可能的原因是001×7陽(yáng)離子交換樹(shù)脂與普洱茶多糖溶液中的物質(zhì)交換基團(tuán)后引起pH值的變化，促使更多的多酚氧化聚合成顏色較深的物質(zhì)。

吸附后的樹(shù)脂用80%酒精解吸4 h，經(jīng)測(cè)定樹(shù)脂解吸前、后吸附固形物質(zhì)量后計(jì)算發(fā)現(xiàn)S-8吸附固形物的解吸率遠(yuǎn)低于D101、HP-20和AB-8樹(shù)脂的解吸率，僅為 11.50%。由于S-8為極性樹(shù)脂，比表面積僅為100～200 m2/g， D101和HP-20樹(shù)脂均為非極性樹(shù)脂，比表面積分別為500～600 m2/g和600 m2/g，AB-8為弱極性樹(shù)脂，比表面積為480～520 m2/g，因而初步推測(cè)普洱茶多糖中色素和蛋白質(zhì)的極性很強(qiáng)，能牢固地吸附在S-8樹(shù)脂上而不易被洗脫釋放出來(lái)，進(jìn)而表明S-8樹(shù)脂再生十分困難，不宜用于普洱茶多糖的脫色和蛋白質(zhì)去除。因此，選擇D101、AB-8及HP-20作進(jìn)一步篩選。

2.2 3 種樹(shù)脂對(duì)茶多糖溶液中色素的動(dòng)態(tài)吸附率

圖 2 3 種樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附茶多糖溶液中色素的效果Fig.2 Dynamic adsorption of pigments present in tea polysaccharide by three types of resins

由圖2可知，D101、AB-8及HP-20樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附普洱茶多糖溶液中的色素均隨上樣液體積的增加而呈現(xiàn)吸附能力下降的趨勢(shì)。其中第2管與第1管相比，吸附色素的能力下降十分明顯，D101、AB-8和HP-20分別下降了23.98%、28.38%和 24.24%，并且第2管的流出液中就含有較高的色素；從第3管開(kāi)始，3種樹(shù)脂對(duì)色素的吸附率都低于70%；第6管時(shí)樹(shù)脂對(duì)色素的吸附率均不到60%。由此表明，樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附普洱茶多糖溶液中色素的效果欠佳。

由圖3與圖1可知，D101、AB-8和HP-20處理4 倍樹(shù)脂體積的普洱茶多糖溶液時(shí)脫色率和蛋白質(zhì)去除率低且效果均不及靜態(tài)吸附法處理10 倍樹(shù)脂體積的普洱茶多糖溶液。依據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推理，3 種樹(shù)脂采用動(dòng)態(tài)吸附法分別處理10 倍樹(shù)脂體積料液，則對(duì)多糖溶液脫色和蛋白質(zhì)去除效果將遠(yuǎn)不及靜態(tài)吸附法。綜合考慮，選擇D101樹(shù)脂采用靜態(tài)吸附法來(lái)脫除普洱茶多糖溶液中的色素與蛋白質(zhì)。

圖 3 3 種樹(shù)脂對(duì)茶多糖溶液動(dòng)態(tài)脫色和蛋白質(zhì)去除的效果Fig.3 Effects of three types of resins on dynamic decolorization and deproteinization of tea polysaccharides

2.3 D101樹(shù)脂靜態(tài)吸附色素的曲線

圖 4 D101樹(shù)脂靜態(tài)吸附色素的曲線Fig.4 Static adsorption curve of D101 resin for pigments

由圖4可知，D101樹(shù)脂對(duì)普洱茶多糖中色素的脫除率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加。當(dāng)脫色時(shí)間在1～3 h內(nèi)，脫色效果隨時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增加，但從4 h延長(zhǎng)至7 h，脫色率略有增加，意味著樹(shù)脂吸附色素在4～7 h接近飽和。這可能與吸附過(guò)程中色素的濃度降低和樹(shù)脂的有效吸附面積減少有關(guān)。考慮到脫色的時(shí)間效率及吸附時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使多糖的保留率偏低，因此，靜態(tài)吸附色素的時(shí)間以5 h為宜。

2.4 D101樹(shù)脂靜態(tài)吸附單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 溫度對(duì)D101樹(shù)脂脫色與蛋白質(zhì)去除的影響

圖 5 溫度對(duì)D101樹(shù)脂脫色和蛋白質(zhì)去除的影響Fig.5 Effect of temperature on decolorization and deproteinization by D101 resin

據(jù)圖5，溫度對(duì)普洱茶多糖溶液的脫色和蛋白質(zhì)去除有一定程度的影響。溫度在20～50 ℃范圍內(nèi)，D101樹(shù)脂對(duì)茶多糖溶液的脫色率隨溫度的升高而增加，蛋白質(zhì)去除率增加明顯；溫度為50 ℃與60 ℃相比，后者脫色率略高于前者，但蛋白質(zhì)去除率明顯下降。可能是當(dāng)溫度低于50 ℃時(shí)隨溫度升高樹(shù)脂功能基團(tuán)活性增強(qiáng)，溶液的黏度下降，色素和蛋白質(zhì)分子的擴(kuò)散速率加快，從而樹(shù)脂吸附3 種分子的速率加快；當(dāng)溫度超過(guò)50 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)同色素的結(jié)合力減弱，色素競(jìng)爭(zhēng)性被樹(shù)脂吸附的能力強(qiáng)于蛋白質(zhì)。綜合考慮脫色率、蛋白質(zhì)去除率和操作溫度的控制，D101樹(shù)脂宜在30～50 ℃范圍使用。

2.4.2 樹(shù)脂用量對(duì)D101樹(shù)脂脫色與蛋白質(zhì)去除的影響

圖 6 樹(shù)脂用量對(duì)D101樹(shù)脂脫色和蛋白質(zhì)去除的影響Fig.6 Effects of resin volume on decolorization and deproteinization by D101 resin

據(jù)圖6，樹(shù)脂用量在3～11 mL范圍內(nèi)時(shí)，D101樹(shù)脂對(duì)茶多糖溶液的脫色率及蛋白質(zhì)去除率隨樹(shù)脂用量的增加而提高，因?yàn)闃?shù)脂用量增加相當(dāng)于單位體積溶液中用于吸附物質(zhì)的樹(shù)脂總表面積增大，樹(shù)脂功能基團(tuán)增多，提高了對(duì)色素和蛋白質(zhì)的吸附量。當(dāng)樹(shù)脂用量超過(guò)11 mL時(shí)，隨樹(shù)脂用量的繼續(xù)增加，脫色率和蛋白質(zhì)去除率進(jìn)一步增加的力度小，但會(huì)使多糖的保留率降低。因此，樹(shù)脂用量以不超過(guò)11 mL為宜。

2.4.3 pH值對(duì)D101樹(shù)脂脫色與蛋白質(zhì)去除的影響

圖 7 pH值對(duì)D101樹(shù)脂脫色和蛋白質(zhì)去除的影響Fig.7 Effect of pH on decolorization and deproteinization by D101 resin

據(jù)圖7，pH值在4.0～6.4范圍內(nèi)時(shí)，D101樹(shù)脂對(duì)普洱茶多糖溶液的脫色率與蛋白質(zhì)去除率隨pH值的降低而明顯升高，因?yàn)閜H值的降低可能有更多的蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)而沉淀析出，同時(shí)會(huì)使離子形式的色素更多地轉(zhuǎn)變?yōu)橐苑肿有问酱嬖诙欣跇?shù)脂的吸附。從脫色率及蛋白質(zhì)去除率的綜合效果來(lái)看，pH值適宜在4.0～5.2范圍內(nèi)。

2.4.4 料液質(zhì)量濃度對(duì)D101樹(shù)脂脫色與蛋白質(zhì)去除的影響

圖 8 料液質(zhì)量濃度對(duì)D101樹(shù)脂脫色和蛋白質(zhì)去除的影響Fig.8 Effect of sample concentration on decolorization and deproteinization by D101 resin

據(jù)圖8，多糖質(zhì)量濃度在0.24～1.90 mg/mL范圍內(nèi)，D101樹(shù)脂對(duì)普洱茶多糖溶液的脫色率和蛋白質(zhì)去除率隨著質(zhì)量濃度的增加而提高。而料液質(zhì)量濃度1.90 mg/mL與3.80 mg/mL 相比較，前者脫色率略有降低，但蛋白質(zhì)去除率增加了6.55%。從脫色率、蛋白質(zhì)去除率、后續(xù)濃縮工序的能耗及效率等方面綜合評(píng)價(jià)，料液質(zhì)量濃度宜控制在0.95～3.80 mg/mL范圍內(nèi)。

2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化脫色與蛋白質(zhì)去除的工藝條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用四因素三水平正交試驗(yàn)法優(yōu)化普洱茶多糖提取液的最佳脫色和蛋白質(zhì)去除條件，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表 2 普洱茶多糖溶液脫色與脫蛋白質(zhì)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Results of orthogonal array experiments for the optimization of resin adsorption conditions

由表2極差分析可看出，pH值對(duì)于脫色率的影響較大，樹(shù)脂用量次之，料液質(zhì)量濃度對(duì)脫色率影響最小。溫度對(duì)于蛋白質(zhì)去除率的影響較大，樹(shù)脂用量次之，pH值對(duì)蛋白質(zhì)去除率影響最小。從數(shù)據(jù)分析確定的脫色和蛋白質(zhì)去除條件相同，即溫度50 ℃、樹(shù)脂用量11 mL、pH 4.0、料液質(zhì)量濃度3.8 mg/mL。

在此條件下進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，普洱茶多糖溶液的脫色率可達(dá)到82.33%，蛋白質(zhì)去除率為70.89%，優(yōu)于正交組合表中各處理的結(jié)果，證明優(yōu)化的條件是合理的。

2.6 纖維素DEAE-52陰離子交換樹(shù)脂分離普洱茶茶多糖

圖 9 普洱茶茶多糖在DEAE-52色譜柱上的洗脫曲線Fig.9 Elution curve of Pu-Erh tea polysaccharide on DEAE-52 column

采用DEAE-52柱層析對(duì)經(jīng)D101樹(shù)脂脫色和脫蛋白質(zhì)的茶多糖進(jìn)行分離，依次經(jīng)H2O和0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 mol/L NaCl溶液梯度洗脫。從圖9可知，檢測(cè)多糖時(shí)，除了0.1 mol/L NaCl溶液洗脫收集的溶液呈現(xiàn)一個(gè)大峰和一個(gè)小峰有交叉之外（二峰視為單峰收集），其他濃度的洗脫劑均可獲得一單峰。第1個(gè)多糖峰對(duì)應(yīng)的溶液在280 nm波長(zhǎng)處有明顯的吸收峰，意味著該溶液可能含有糖與蛋白質(zhì)的結(jié)合物，第2、3個(gè)多糖峰對(duì)應(yīng)的溶液在280 nm波長(zhǎng)處有一個(gè)很小的吸收峰，余下各多糖峰對(duì)應(yīng)的溶液在280 nm波長(zhǎng)處未見(jiàn)吸收峰。合并各主峰對(duì)應(yīng)的收集液，減壓濃縮，透析48 h后袋內(nèi)溶液減壓濃縮，冷凍干燥得到多糖級(jí)分，按照收集的先后順序依次命名為T(mén)PSⅠ、TPSⅡ、TPSⅢ、TPSⅣ、TPSⅤ和TPSⅥ。

3 討 論

普洱茶屬于后發(fā)酵茶，多酚氧化程度高，產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物茶黃素、茶紅素、茶褐素為普洱茶色素。普洱茶中茶色素具有含量高，極性很大且存在部分與多糖及蛋白質(zhì)結(jié)合的特點(diǎn)，完全不同于絕大多數(shù)植物多糖提取液中的色素，色素的脫除十分困難。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)活性炭對(duì)普洱茶多糖溶液幾乎沒(méi)有脫色效果；過(guò)氧化氫的脫色率約為45.2%，但考慮到過(guò)氧化氫有可能破壞多糖結(jié)構(gòu)及引起普洱茶中簡(jiǎn)單多酚氧化聚合成有顏色的物質(zhì)而未作深入研究；傳統(tǒng)的Sevag法5 次蛋白質(zhì)去除率僅為36.83%；溶液中終質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%胰蛋白酶與Sevag法5 次相結(jié)合時(shí)蛋白質(zhì)去除率為49%。因此，常用的多糖脫色和蛋白質(zhì)去除方法均不適合于普洱茶多糖溶液的直接脫色與蛋白質(zhì)去除。

本研究采用樹(shù)脂進(jìn)行普洱茶多糖同步脫色和蛋白質(zhì)去除，與常規(guī)的多糖脫蛋白、脫色方法相比，具有工序少、操作簡(jiǎn)單、溶劑安全、處理量大、周期短等優(yōu)點(diǎn)。夏瑋等[23]用高效凝膠過(guò)濾色譜測(cè)定了樹(shù)脂對(duì)多糖脫色前后的色譜圖，結(jié)果色譜圖形狀大致相同，只是不同部分峰高有一定程度的降低，樹(shù)脂對(duì)不同分子質(zhì)量范圍的多糖都有一定吸附作用，不會(huì)專一性吸附凝膠過(guò)濾色譜峰中單峰對(duì)應(yīng)的多糖，也不會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)。因此，采用樹(shù)脂進(jìn)行普洱茶多糖同步脫色和蛋白質(zhì)去除不僅為后續(xù)研究普洱茶多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)與生物活性奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也為研究其他植物原料經(jīng)微生物發(fā)酵后提取的多糖脫色和蛋白質(zhì)去除提供了重要的技術(shù)參考。

此外，用纖維素DEAE-52樹(shù)脂分離經(jīng)D101樹(shù)脂脫色和蛋白質(zhì)去除的普洱茶多糖，得到6 個(gè)多糖級(jí)分，經(jīng)透析、濃縮和冷凍干燥后根據(jù)顏色深淺和多糖含量高低，可優(yōu)先選擇TPSⅠ和TPSⅡ用于進(jìn)一步分離純化、結(jié)構(gòu)表征與功效研究。本研究還表明D101樹(shù)脂對(duì)普洱茶多糖溶液中色素的吸附率高達(dá)82.33%，故可以對(duì)吸附的色素進(jìn)行洗脫收集及進(jìn)一步的分離純化、結(jié)構(gòu)與藥理活性研究，也許將有助于深化茶葉科學(xué)的相關(guān)理論和深度開(kāi)發(fā)普洱茶色素。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)篩選出D101樹(shù)脂適合于對(duì)普洱茶多糖同時(shí)脫色和蛋白質(zhì)去除，并優(yōu)化了其對(duì)普洱茶多糖溶液脫色和蛋白質(zhì)去除的條件：當(dāng)普洱茶多糖溶液體積為50mL時(shí)，溫度50 ℃、樹(shù)脂用量11 mL、pH 4.0、料液質(zhì)量濃度3.8 mg/mL。在此條件下普洱茶多糖溶液的脫色率高達(dá)82.33%，蛋白質(zhì)去除率為70.89%。用纖維素DEAE-52陰離子樹(shù)脂分離經(jīng)D101樹(shù)脂脫色和蛋白質(zhì)去除的普洱茶多糖能得到6 個(gè)多糖級(jí)分。

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Purifi cation and Separation of Pu-Erh Tea Polysaccharide by Resin

YANG Xinhe1,2, HUANG Jian’an2, LIU Zhonghua1,2,*, MAO Qingli1,2
(1. School of Life Science and Technology, Hubei Engineering University, Xiaogan 432000, China; 2. National Research Center of Engineering & Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Changsha 410128, China)

Among ten types of macroporous resins, D101 resin was selected as the best for the decolorization and deproteinization of Pu-Erh tea polysaccharides. When 50 mL of the sample at a concentration of 3.8 mg/mL, pH 4 was adsorbed by 11 mL of D101 resin 50 ℃, the decolorization rate was 82.33% and the removal rate of protein was 70.89%. Six polysaccharide fractions were obtained after subsequent DEAE-52 cellulose column chromatography.

resin; Pu-Erh tea; polysaccharide; purifi cation; separation

S571.1

A

1002-6630（2015）02-0019-06

10.7506/spkx1002-6630-201502004

2014-06-20

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31370692；31370691）；湖北省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2014CFB573）

楊新河（1974—），男，副教授，博士，主要從事茶及功能食品研究。E-mail：hbxhyang@163.com

*通信作者：劉仲華（1965—），男，教授，博士，主要從事茶及功能食品研究。E-mail：lark-liu@163.com