響應面法優化蛇足石杉中石杉堿甲的提取工藝

楊 婷，武 蕓*，張 澤，武玉蓮，鄭小江，胡世坤，毛 鑫

（1.湖北民族學院 生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學院生物科學與技術學院，湖北 恩施 445000；3.湖北民族學院附屬民大醫院，湖北 恩施 445000；4.四川大學生命科學學院，四川 成都 610064）

響應面法優化蛇足石杉中石杉堿甲的提取工藝

楊 婷1,2,4，武 蕓1,2,*，張 澤3，武玉蓮3，鄭小江1,2，胡世坤2，毛 鑫2

（1.湖北民族學院 生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學院生物科學與技術學院，湖北 恩施 445000；3.湖北民族學院附屬民大醫院，湖北 恩施 445000；4.四川大學生命科學學院，四川 成都 610064）

利用響應面分析法優化恩施州蛇足石杉中石杉堿甲的提取工藝條件。在以提取溫度、提取時間、料液比、酒石酸質量分數為影響因素，以石杉堿甲提取量為指標的單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken原理設計三因素三水平的試驗分析法，得到提取石杉堿甲最佳工藝條件：料液比1∶30（g/mL）、酒石酸質量分數1.5%、提取溫度41 ℃。采用高效液相色譜法檢測石杉堿甲含量，在最優提取條件下，熱水浸提4 h，石杉堿甲提取量為11.1928 mg/100 g。

蛇足石杉；石杉堿甲；響應面分析法；高效液相色譜

蛇足石杉（Huperzia serrata）又名千層塔、蛇足石松，為石杉科石杉屬多年生蕨類草本植物[1-4]，其有效成分主要是生物堿，生物堿對人類健康有著至關重要的作用，特別是石杉堿甲是目前唯一已知的治療老年癡呆癥的特效藥[5-9]。隨著社會老齡化的加劇，有可能使罹患老年癡呆癥的老年人越來越多，也會使具有特殊治療功能的石杉堿甲的需求量越來越大，研究與開發蛇足石杉具有很重要的現實意義。蛇足石杉對環境條件要求苛刻，生長緩慢，市場需求量大，在人工合成石杉堿甲的工藝條件還不成熟的情況下，研究提高石杉堿甲的提取率有重要意義[10]。

關于蛇足石杉中石杉堿甲提取工藝的相關文獻報道比較多。石杉堿甲含量的測定主要利用比色法和高效液相色譜法，高效液相色譜法具有精確度高、分離效果好等優點，適用于微量物質的測定，目前多利用此法測定石杉堿甲含量。易學文等[11]利用纖維素酶有降解植物細胞壁的特性提取石杉堿甲，但是酶活性易受外界環境影響，價格昂貴，不易實現工業化。近年來多數學者集中在探究不同酸性提取液和酸性提取液pH值對石杉堿甲得率的影響，研究不同洗脫條件下石杉堿甲與其他雜質的分離度[12-13]。何春萍等[14]比較了4 種傳統工藝條件對石杉堿甲得率的影響，利用超聲法比較了蛇足石杉不同部位中石杉堿甲的含量。研究者在傳統工藝條件的基礎上，利用超聲波、微波輔助提取，提高石杉堿甲的提取率[14-15]。利用數學模型優化試驗條件是生物學研究的基礎，楊煌記[16]和張馨[17]等利用正交設計優化石杉堿甲提取工藝條件，利用響應面分析法優化石杉堿甲的提取工藝鮮有報道。

本實驗在已有研究的基礎上，通過響應面分析法優化恩施州蛇足石杉中石杉堿甲的提取工藝，利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定石杉堿甲的含量，提高石杉堿甲的提取量，對推動生物醫藥產業發展和技術進步具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所用材料均采自華中藥用植物園。將采集的蛇足石杉整個植株地上部分洗凈，自然晾干，于55～60 ℃烘箱中烘至質量恒定，用粉碎機磨成粉末，過60 目篩后裝于試劑瓶中，貼上標簽，置于干燥器中備用。

甲醇（色譜純） 德國Sigma公司；石杉堿甲標準品 廣州同雋醫藥科技有限公司；酒石酸、三乙醇胺、磷酸（均為分析純） 恩施州紅霞化工有限公司；雙蒸水 實驗室自制。

1.2 儀器與設備

RT-02A植物樣品粉碎機 弘荃機械企業有限公司；FAI10048電子天平 上海精科天美商貿有限公司；GZX-9140MBE數顯鼓風干燥箱 上海迅博實驗有限公司醫療設備廠；DIONEX高效液相色譜儀 戴安中國有限公司；Diamonsil HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海迅博實驗有限公司醫療設備廠；KQ5200E型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q純水儀/超純水（電阻率18.2 MΩ/cm2） 美國Millipore公司；J-30I冷凍離心機 美國Beckman公司；進樣針、有機濾膜（0.22 μm） 海寧圣華過濾設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 石杉堿甲提取工藝流程

精確稱取蛇足石杉粉末1.000 g→溶于1.5%酒石酸溶液超聲波輔助提取30 min→一定溫度條件下熱水浸提一段時間（變量）→冷凍離心15 min（10 000 r/min）→取上清液→用氯仿（10 mL）萃取→濃縮→酒石酸定容至25 mL→HPLC測石杉堿甲含量。

1.3.2 HPLC條件[17-19]

色譜柱為Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為體積分數0.02%甲醇-三乙胺（甲醇與三乙胺體積比9∶1，pH 7.5），流速0.8 mL/min，檢測波長311 nm，柱溫25℃，進樣量20 μL。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 酒石酸質量分數對石杉堿甲提取量影響

精密稱取1.000 g蛇足石杉粉末15份（各3次重復）于錐形瓶中，分別加入0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的酒石酸15 mL，超聲30 min后，于50 ℃熱水中提取1 h，10 000 r/min離心15min，收集上清液，氯仿萃取，濃縮，定容到25 mL，0.22 μm濾膜過濾，進樣20 μL，于311 nm波長處測石杉堿甲峰面積，比較酒石酸質量分數對石杉堿甲提取量的影響。

1.3.3.2 提取時間對石杉堿甲提取量的影響

分別精密稱取1.000 g蛇足石杉粉末15 份（3 次重復）于錐形瓶中，加入2.0%酒石酸溶液15 mL，提取溫度為50 ℃，研究提取時間對石杉堿甲提取量的影響。

1.3.3.3 料液比對石杉堿甲提取量的影響

提取時間為4h，溫度為50℃，酒石酸質量分數為2.0%的條件下，料液比分別為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g/mL），研究料液比對石杉堿甲提取量的影響。

1.3.3.4 提取溫度對石杉堿甲提取量的影響

研究提取溫度變量對石杉堿甲提取量的影響，提取時間4 h、料液比1∶35、酒石酸質量分數2.0%的條件下，提取溫度分別為30、40、50、60、70、80 ℃。

1.3.4 Box-Behnken試驗設計

根據Box-Behnken試驗設計原理及單因素試驗的結果，選取對試驗結果有顯著影響的因素，設計三因素三水平的響應面試驗方案（表1）。

表 1 Box-Behnken試驗設計因素水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

2 結果與分析

2.1 石杉堿甲的穩定性分析

2.1.1 石杉堿甲的HPLC圖

通過對色譜柱及流動相研究，選擇合適實驗條件，利用1.3.2節色譜條件掃描標準品和樣品中石杉堿甲的色譜圖見圖1，石杉堿甲的保留時間較長，分離度較高，表明石杉堿甲與其他成分能夠很好地分離，此條件有利于石杉堿甲含量的測定。

圖 1 石杉堿甲標準品及樣品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC of huperzine A standard and huperzine A extracted from Huperzia serrata

2.1.2 穩定性實驗

取0.01 mg/mL石杉堿甲對照品溶液，分別放置2、4、6、8、10 h后進樣，測定日內精密度，石杉堿甲峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為1.169%、1.170%、1.172%、1.173%、1.171%；連續3 d重復實驗，測定日間精密度，RSD分別為1.161%、1.184%、1.201%，結果表明穩定性良好。

2.1.3 精密度實驗

取0.01 mg/mL石杉堿甲對照品溶液，重復進樣5 次，測石杉堿甲峰面積的RSD為1.664%（n=5）。

2.2 線性關系考察

精密稱取石杉堿甲標準品0.500 mg，溶解在1.5%酒石酸溶液中，定容到50 mL，配制成0.01 mg/mL石杉堿甲標準品溶液。分別吸取石杉堿甲標準品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL于10 mL容量瓶中配成不同質量濃度的對照品溶液，過0.45 μm濾膜，進樣20 μL，于311 nm波長處分別測定峰面積。以峰面積為橫坐標，對照品質量濃度為縱坐標，對其進行線性回歸，繪制標準曲線。得回歸方程：y=0.001x+0.000 2，R2=0.999 6，結果表明石杉堿甲在0.5～5 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 酒石酸質量分數對石杉堿甲提取量的影響

圖 2 酒石酸質量分數對石杉堿甲提取量的影響Fig.2 Effect of tartaric acid concentration on the yield of huperzine A

表 2 不同酒石酸質量分數條件下石杉堿甲提取量Duncan多重比較（n= 3）Table 2 Duncan s comparison for the yield of huperzine A with different concentrations of tartarid acid (n= 3)

圖2表明，當酒石酸質量分數為2.0%時，石杉堿甲提取量最高，可能是因為酒石酸質量分數為2.0%時溶解度達到飽和，當酒石酸質量分數繼續升高時，石杉堿甲的提取量不但沒有提高反而下降了。為了弄清所選取水平的區分度，通過SPSS 18.0軟件分析得到多重比較結果（表2），酒石酸質量分數的5 個水平均沒有在同一列，表明酒石酸質量分數的這5 個水平之間均具有顯著性差異。

2.3.2 提取時間對石杉堿甲提取量的影響

圖 3 提取時間對石杉堿甲提取量的影響Fig.3 Effect of extraction duration on the yield of huperzine A

如圖3所示，提取時間對石杉堿甲提取量影響不大，當時間為4 h時石杉堿甲提取量最高。可能是因為在4 h前，植物細胞壁沒有被全部穿透，石杉堿甲沒有完全被釋放出來，但是當提取時間過長時，石杉堿甲經過長時間受熱，溶解成分被破環或者其他浸出物與石杉堿甲發生了反應。由表3可知，時間長短對試驗結果的多重比較分析中，提取時間1 h和提取時間5 h（在同一列）石杉堿甲提取量差異不明顯，與其他水平之間有顯著性差異。因此，在響應面試驗中，提取時間選取4 h。

表 3 不同提取時間條件下石杉堿甲提取量Duncan多重比較（n = 3）Table 3 Duncan s comparison for the yield of huperzine A different extraction durations (n= 3)

2.3.3 料液比對石杉堿甲提取量的影響

圖 4 料液比對石杉堿甲提取量的影響Fig.4 Effect of material-to-liquid ratio on the yield of huperzine A

表 4 不同料液比條件下石杉堿甲提取量Duncan比較（n = 3）Table 4 Duncan s comparison for the yield of huperzine A with different material-to-liquid ratios (n = 3)

如圖4所示，當料液比為1∶35時，石杉堿甲提取量最高（9.2 mg/100 g）。多重比較分析結果見表4，各因素都不在同一列，它們之間都具有顯著性差異。

2.3.4 提取溫度對石杉堿甲提取量的影響

如圖5所示，當溫度為40 ℃時，生物堿石杉堿甲的化學結構較少被破壞，溶解速率較快，使得石杉堿甲提取率最好。當溫度高于40 ℃時，生物堿的化學結構遭到較為嚴重的破壞，化學結構被破壞的速率比增加的溶解速率要快，兩者的綜合作用，導致石杉堿甲提取量反而下降了，顯著性分析結果見表5，溫度對石杉堿甲的浸提具有顯著性影響。

圖 5 提取溫度對石杉堿甲提取量的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the yield of huperzine A

表 5 不同提取溫度條件下石杉堿甲提取量Duncan比較（n = 3）Table 5 Duncan s comparison for the yield of huperzine A with different extraction temperatures (n = 3)

2.4 響應面試驗結果

表 6 響應面試驗設計與結果Table 6 Response surface experimental design and results

以單因素試驗結果為基礎，選擇對石杉堿甲提取量有顯著影響的提取因素（酒石酸質量分數、料液比、提取溫度），響應面設計及結果見表6。對試驗結果進行多元回歸擬合，通過多重分析，考察不同因素水平對試驗結果的影響，同時得到二次回歸方程為：Y=9.67—0.73A+ 0.17B+0.19C+0.23AB—0.15AC+0.14BC+0.63A2+0.37B2—0.94C2。由表7可知，對石杉堿甲提取量有顯著影響的是酒石酸質量分數的一次方及二次方，提取溫度的二次方對試驗結果影響極顯著。

表 7 回歸方差分析結果Table 7 Analysis of variance of the regression equation

2.5 響應面法優化石杉堿甲提取量的工藝條件

根據回歸方程在考察范圍內繪制酒石酸質量分數、料液比、提取溫度這3 個因素的等高線及三維效果圖（圖6～8）。各圖均是以一個因素為零點，研究其他兩個因素對石杉堿甲提取量的影響。

圖 6 酒石酸質量分數和料液比對石杉堿甲提取量的影響Fig.6 Effects of tartaric acid concentration and material-to-liquid ratio on the yield of huperzine A

圖 7 提取溫度和料液比對石杉堿甲提取量的影響Fig.7 Effects of extraction temperature and material-to-liquid ratio on the yield of huperzine A

圖 8 提取溫度和酒石酸質量分數對石杉堿甲提取量的影響Fig.8 Effects of extraction temperature and tartaric acid concentration on the yield of huperzine A

為了得到提取石杉堿甲的最佳工藝條件，通過對以上數據的分析，得知酒石酸質量分數1.5%、料液比1∶30、提取溫度41 ℃時，石杉堿甲提取量為11.38 mg/100 g。

2.6 驗證實驗

為驗證響應面分析法所得模型的準確性，取酒石酸質量分數1.5%、料液比1∶30、提取溫度41 ℃、提取時間4 h，對模型進行4 次平行驗證實驗，得到平均提取量為11.192 8 mg/100 g，結果見表8。通過分析表8的數據，可見該模型能較好地模擬和預測千層塔中石杉堿甲提取量，為優化石杉堿甲提取工藝條件提供了可靠的理論依據。

表 8 驗證實驗結果Table 8 Validation of optimized extraction conditions

3 結 論

根據Box-Behnken試驗設計原理和響應面分析方法，利用Design-Expert 7.0軟件進行試驗設計和統計分析，得到了石杉堿甲提取量與料液比、酒石酸質量分數和提取溫度的回歸模型，對方程進行求解得到提取石杉堿甲的最佳工藝條件為料液比1∶30、酒石酸質量分數1.5%、提取溫度41 ℃，石杉堿甲提取量為11.1928 mg/100 g。通過驗證性實驗，證明此條件下石杉堿甲提取量的可靠性，恩施州蛇足石杉石杉堿甲含量高于相關的報道[20-22]，可能是蛇足石杉產地及品種不同的緣故。為了驗證這一推測，在此最佳條件下檢測了貴州產的蛇足石杉中石杉堿甲的含量，其提取量僅為2.15 mg/100 g，說明石杉堿甲含量的高低可能與產地和品種有關，也可能與產石杉堿甲的內生真菌的種類和數量有關[23-26]。

[1] 吳其浚. 植物名實圖考[M]. 北京: 中華書局, 1963: 418.

[2] 駱和生, 張俊榮. 全國中草藥匯編: 上冊[M]. 北京: 人民衛生出版社, 1975: 123.

[3] 中國科學植物研究所. 中國高等植物圖鑒[M]. 北京: 科學出版社, 1972: 107.

[4] 郭斌, 徐玲玲, 尉亞輝, 等. 千層塔的研究進展[J]. 中國中藥雜志, 2009, 34(16): 2018-2022.

[5] 武蕓, 楊婷, 楊蘭, 等. 珍稀瀕危藥材蛇足石杉的研究概況及開發前景[J]. 湖北民族學院學報: 自然科學版, 2013, 31(1): 89-92.

[6] LUO Hongmei, LI Ying, SUN Chao, et al. Comparison of 454-ESTs from Huperzia serrata and Phlegmariurus carinatus reveals putative genes involved in lycopodium alkaloid biosynthesis and developmental regulation[J]. BMC Plant Biology, 2010, 10: 209.

[7] ZHANG Zhibin, ZENG Qinggui, YAN Riming, et al. Endophytic fungus Cladosporium cladosporioides LF70 from Huperzia serrata produces huperzine A[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology 2011, 27: 479-486.

[8] 徐泓, 唐希燦. 石杉堿乙的抗膽堿酯酶作用[J]. 中國藥理學報, 1987, 8(1): 18-32.

[9] 劉鐵薇. 石杉堿甲的藥理作用與臨床研究進展[J]. 中藥材, 2001, 24(10): 775-776.

[10] 覃大吉, 楊永康, 向極釬, 等. 恩施州千層塔野生資源研究[J]. 湖北農業科學, 2010, 49(4): 904-907.

[11] 易學文, 張利, 羅榮珍, 等. 蛇足石杉中石杉堿甲的酶法提取研究[J].安徽農業科學, 2011, 39(32): 19798-19799; 19838.

[12] 張衛剛, 侯文潔, 王濤, 等. 響應面法設計優化石杉堿甲提取工藝研究[J]. 廣東化工, 2013, 40(11): 18-20.

[13] 李紅英, 向級釬. 千層塔中石杉堿甲的提取方法選擇[J]. 安徽農業科學, 2007, 37(33): 16376-16377.

[14] 何春萍, 何挺, 舒春月, 等. 貴州蛇足石杉不同部位石杉堿甲含量測定[J]. 懷化學院學報, 2014, 33(5): 1-4.

[15] 楊郭, 林艷, 周宇, 等. 微波預處理提取蛇足石杉中總生物堿的工藝優化[J]. 化學研究與應用, 2009, 21(8): 1213-1215.

[16] 楊煌記, 黃暉, 陳東菊, 等. 三明地區長柄石杉中石杉堿甲的提取和測定[J]. 應用化工, 2008, 37(12): 1416-1418.

[17] 張馨, 陳靖, 曾毅梅, 等. 千層塔中石杉堿甲的提取工藝優化[J]. 中國現代中藥, 2008 , 10(11): 26-28.

[18] 張敬彩, 魏杰. 高效液相色譜法定量測定中藥千層塔提取物中的石杉堿甲[J]. 色譜, 2013, 31(1): 79-82.

[19] 王俊, 吳偉, 潘勝. HPLC法測定6種石杉科植物中石杉堿甲的含量[J].中草藥, 2003, 34(7): 607-608.

[20] 查圣華, 李秀男, 孫海虹, 等. 從蛇足石杉中超聲提取石杉堿甲和石杉堿乙[J]. 天然產物研究與開發, 2005, 17(1): 7-10.

[21] 黃驥, 趙愛玲. 蛇足石杉中石杉堿甲含量的動態變化分析[J]. 中國中藥雜志, 2010, 35(19): 2511-2515.

[22] 袁經權, 周小雷, 王碩, 等. HPLC測定不同產地與不同部位千層塔中石杉堿甲和石杉堿乙含量[J]. 藥物分析雜志, 2012, 32(9): 1541-1549.

[23] 董麗輝, 范三微, 凌慶枝, 等. 千層塔中產石杉堿甲內生真菌的研究[J].天然產物研究與開發, 2014, 26(5): 650-655.

[24] 王德立, 甘炳春, 齊耀東, 等. 蛇足石杉不同生長階段植株中石杉堿甲含量的地區差異及生境影響的比較觀察[J]. 中國新藥雜志, 2014, 23(3): 326-332.

[25] 汪涯, 曾慶桂, 張志斌, 等. 蛇足石杉內生真菌分離及其抑制乙酰膽堿酯酶活性研究[J]. 中國中藥雜志, 2011, 36(6): 734-740.

[26] 黎萬奎, 周吉燕, 林子為, 等. 蛇足石杉內生真菌2F09P03B產石杉堿甲發酵條件的研究[J]. 中國醫藥生物技術, 2007, 2(4): 254-259.

Optimization of Extraction Process for Huperzine A from Huperzia serrata

YANG Ting1,2,4, WU Yun1,2,*, ZHANG Ze3, WU Yulian3, ZHENG Xiaojiang1,2, HU Shikun2, MAO Xin2
(1. Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization of Hubei Province, Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000, China; 2. College of Biological Scientifi c and Technical, Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China; 3. University Hospital of Hubei University for Nationalities, Enshi 445000, China; 4. College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China)

This paper is concerned with the selection and optimization of important extraction parameters as well as their levels for the increased yield of huperzine A from the aboveground parts of Huperzia serrata by combined use of single factor method and response surface methodology (RSM). Solid-to-solvent ratio, solvent concentration and temperature were identifi ed as main variables that affect extraction effi ciency, and their levels were optimized using RSM based on a threevariable, three-level Box-Behnken design. When the extraction was performed for 4 h under the optimized conditions: 1.5% tartaric acid as extraction solvent with a solid-to-solvent ratio of 1:30 (g/mL) and an extraction temperature of 41 ℃, the yield of huperzine A was 11.192 8 mg/100 g.

Huperzia serrata; huperzine A; response surface analysis; high performance liquid chromatography

TS201

A

1002-6630（2015）02-0057-06

10.7506/spkx1002-6630-201502011

2014-06-30

湖北省教育廳科學技術研究項目（D20141903）；湖北省自然科學基金項目（2014CFB615）；生物資源保護與利用湖北省重點實驗室開放基金項目（PKLHB1301）；恩施州2013科技研究與開發項目（2013002）；國家級大學生創新課題項目（201210517030）；湖北民族學院大學生創新訓練計劃項目（2014Z064）；

湖北民族學院林學一級學科（0907）資助項目

楊婷（1991—），女，學士，主要從事天然產物的提取與分離研究。E-mail：1287439660@qq.com

*通信作者：武蕓（1971—），女，副教授，碩士，主要從事植物生物技術及生物資源保護與利用研究。E-mail：wuyun2058@sohu.com