大鼠血漿中枸杞多糖熒光標記物定量分析方法的建立

陳 忱，唐華麗，馬 月，王少康，楊立剛，彭 景，孫桂菊,*

（1.東南大學公共衛生學院營養與食品衛生學系，教育部環境醫學工程重點實驗室，江蘇 南京 210009；2.無錫工藝職業技術學院，江蘇 無錫 214200；3.重慶三峽學院 生命科學與工程學院，重慶 404000；4.揚州大學旅游烹飪學院，江蘇 揚州 225000）

大鼠血漿中枸杞多糖熒光標記物定量分析方法的建立

陳 忱1,2，唐華麗1,3，馬 月1，王少康1，楊立剛1，彭 景4，孫桂菊1,*

（1.東南大學公共衛生學院營養與食品衛生學系，教育部環境醫學工程重點實驗室，江蘇 南京 210009；2.無錫工藝職業技術學院，江蘇 無錫 214200；3.重慶三峽學院 生命科學與工程學院，重慶 404000；4.揚州大學旅游烹飪學院，江蘇 揚州 225000）

建立大鼠血漿中異硫氰酸熒光素標記的枸杞多糖（fluorescein isothiocyanate labeled Lycium barbarum polysaccharides，LBP-FITC）的熒光定量分析方法，線性方程為y=1 378.7x—14.98（R2=0.998 9），血漿中LBP-FITC質量濃度在0.05～10 μg/mL范圍內與熒光強度呈良好的線性關系。方法的精密度、回收率以及穩定性考察分析證明該方法符合生物樣品體內定量分析的要求。單次灌胃給予大鼠LBP-FITC后，以藥代動力學WinNonlin軟件采用非房室模型擬合大鼠單次口服LBP-FITC的經時血藥質量濃度數據，計算主要的藥代動力學參數為最大峰質量濃度（Cmax）（2.39±0.71） μg/mL、達峰時間（tmax）（1.17±0. 41） h；藥時曲線下面積AUC0-t為（45.85±7.12）（μg?h）/mL，AUC0-∞為（127.31±39.00）（μg?h）/mL；半衰期（t1/2）為（80.32±32.70） h；清除率為（1 693.96±492.47）mL/kg；平均滯留時間為（20.64±1.36） h。

異硫氰酸熒光素標記的枸杞多糖；藥代動力學；穩定性；回收率

藥物代謝動力學的研究是生物活性物質研究的一項重要內容，其運用數學原理和方法闡述藥物在機體內的動態規律，主要研究被測對象在生物體內的過程，包括吸收、分布、代謝和排泄[1]。枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides，LBP）是枸杞發揮功效的重要成分，體內外實驗證實LBP具有多種功效，例如抗氧化、調節免疫、抗衰老、降血糖、降血脂、抗動脈粥樣硬化等[2-6]。但作用機理目前研究并不深入，尤其是與功效學研究相比，LBP的代謝動力學研究鮮見報道。LBP是一種蛋白多糖，易溶于水，但是其沒有光吸收基團和發色基團，不能采用光譜法或色譜法進行直接檢測。本實驗組通過異硫氰酸熒光素（fl uorescein isothiocyanate，FITC）與LBP的共價偶聯，實現對枸杞多糖的熒光標記，成功制備得到熒光探針LBP-FITC，并且標記產物具有良好的體外穩定性，因此可通過測定其熒光強度對其進行定量分析，從而克服了LBP難以進行高靈敏度檢測的困難[7]。有研究發現該標記方法對多糖生物活性影響較小，對細胞不產生毒性[8-9]。

本實驗建立了大鼠血漿中LBP-FITC的定量分析方法，應用已建立的定量分析方法對LBP-FITC 單次口服給藥的大鼠代謝動力學進行研究，以期為多糖的功效機制研究提供良好的依據。

1 材料與方法

1.1 材料、實驗動物與試劑

枸杞購自寧夏銀川市場。

清潔級SD雄性大鼠（體質量200～250 g，動物許可證號：SCXK（滬）2012-0006） 上海杰思捷實驗動物有限公司。

FITC 美國Sigma公司；單糖標準品為分析純。

1.2 儀器與設備

L-550離心機 湖南離心機儀器有限公司；電子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；Mithras LB 940多功能酶標儀 德國Berthold公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞多糖的提取與熒光標記

本研究的LBP采用膜分離技術提取，Sevag法脫蛋白[10]，純化得到的多糖。紫外和紅外光譜分析證明LBP是一種與蛋白結合的復合多糖，存在β-D型吡喃糖和α-異構體吡喃糖。離子色譜分析發現LBP中單糖含量最高的是葡萄糖，其次是阿拉伯糖和半乳糖。LBP熒光標記參照文獻[11]報道，主要過程為將制備的LBP溶于水中，0.5 mol/mL NaHCO3溶液調節pH值至8.0，加入FITC，室溫避光攪拌反應24 h。反應結束后，將反應液采用中速定性濾紙過濾，向濾液中加入無水乙醇至乙醇終體積分數為80%，沉淀析出，離心棄去上清液。沉淀加水復溶，無水乙醇再沉淀，反復3 次。再將沉淀用無水乙醇反復洗滌，直至上清液無熒光吸收后，凍干沉淀得LBP-FITC。

1.3.2 實驗動物

體質量200～250 g SD雄性大鼠飼養于東南大學公共衛生學院動物實驗室，期間提供標準動物飼料，自由飲水進食。符合衛生部頒布的《衛生部醫學實驗動物管理實施細則》和《實驗動物管理條例》的規定。

1.3.3 實驗設計

1.3.3.1 LBP-FITC在大鼠血漿中的定量分析方法研究

參考其他方法[12-13]對血漿中LBP-FITC進行定量分析。

LBP-FITC標準貯備液的配制：精確稱取LBP-FITC樣品100 mg，置于100 mL容量瓶中，加入磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度，配制成1 mg/mL的LBP-FITC標準貯備液，于4 ℃條件下保存。

LBP-FITC標準系列溶液的配制：臨用時精密量取貯備液適量，用磷酸鹽緩沖溶液配制成質量濃度0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg/mL的LBP-FITC標準系列溶液。

1.3.3.2 實驗動物處理

實驗前大鼠自由攝食和飲水，在適應環境3 d后進行實驗。通過股動脈取血，血樣放入EDTA處理過的管中，在4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液獲得空白血漿，置于EP管中可立即使用或置于—70 ℃冰箱中保存備用。

1.3.3.3 樣品測定LBP-FITC的測定

采用多功能酶標儀，在熒光激發波長495 nm、發射波長520 nm條件下測定其熒光強度。取大鼠血漿150 μL至黑色酶標板中測定熒光強度。

1.3.3.4 標準曲線的繪制

取大鼠空白血漿120 μL，精密加入30 μL不同質量濃度的LBP-FITC標準系列溶液，配制成相當于質量濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10 μg/mL的血漿樣品，同時制備同體積的磷酸緩沖液代替LBP-FITC標準溶液用以測定空白血漿樣品，之后按照1.3.3.3節操作。以血漿中待測樣品LBP-FITC的質量濃度為橫坐標，測定的熒光強度扣除空白血漿的熒光強度為縱坐標，用加權最小二乘法進行回歸運算，所得的直線回歸方程即為標準曲線。

1.3.3.5 方法的精密度考察

取大鼠空白血漿120 μL，精密加入不同質量濃度LBP-FITC標準溶液，分別制備低（0.1 μg/mL）、中（1 μg/mL）、高（10 μg/mL）3 個質量濃度的質量控制（quality control，QC）樣品，每一質量濃度進行5 樣本分析。按照1.3.3.3節操作，將扣除空白血漿熒光強度后的值代入當天相應的標準曲線，分別計算QC樣品測得的質量濃度，與配制的質量濃度進行對照求得方法的精密度。在同一天內重復測定5 次，連續測定5 d，以計算日內和日間相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.3.6 方法的回收率考察

取大鼠空白血漿120 μL，精密加入不同質量濃度LBP-FITC標準溶液，分別制備低（0.1 μg/mL）、中（1 μg/mL）、高（10 μg/mL）3 個質量濃度的QC樣品，每一質量濃度進行5 樣本分析。按照1.3.3.3節操作，每個樣品測定5 次，將扣除空白血漿熒光強度后的值代入當天相應的標準曲線，分別計算QC樣品測得的質量濃度，與配制的質量濃度對照求得方法的回收率。相對回收率的計算見以下公式：

1.3.3.7 方法的穩定性考察

取大鼠空白血漿120 μL，精密加入不同質量濃度LBP-FITC標準溶液，分別制備低（0.1 μg/mL）、中（1 μg/mL）、高（10 μg/mL）3 個質量濃度的QC樣品，反復凍融3 次（—20～25 ℃），每一質量濃度進行5 樣本分析，按照1.3.3.3節操作，每個樣品測定5 次，將扣除空白血漿熒光強度后的值代入當天相應的標準曲線，分別計算QC樣品測得的質量濃度，計算RSD，考察樣品在反復凍融3 次后的穩定性。

另取大鼠空白血漿120 μL，精密加入不同質量濃度LBP-FITC標準溶液，分別制備低（0.1 μg/mL）、中（1 μg/mL）、高（10 μg/mL）3 個質量濃度的QC樣品，每一質量濃度進行5 樣本分析，于室溫（25 ℃）條件下放置24 h，按照1.3.3.3節操作，每個樣品測定5 次，將扣除空白血漿熒光強度后的值代入當天相應的標準曲線，分別計算QC樣品測得的質量濃度，計算RSD，考察樣品在室溫（25 ℃）情況下放置24 h后的穩定性。

取大鼠空白血漿120 μL，精密加入不同質量濃度LBP-FITC標準溶液，分別制備低（0.1 μg/mL）、中（1 μg/mL）、高（10 μg/mL）3 個質量濃度的QC樣品，每一質量濃度進行5 樣本分析，于—20 ℃條件下貯存15 d后取樣，迅速融化，按照1.3.3.3節操作，每個樣品測定5 次，將扣除空白血漿熒光強度后的值代入當天相應的標準曲線，分別計算QC樣品測得的質量濃度，計算RSD，考察樣品在—20 ℃冷凍條件下貯存半個月后的穩定性。

1.3.3.8 單次口服LBP-FITC的大鼠代謝動力學研究

健康雄性SD大鼠（200～250 g）6 只，在適應環境3 d后進行實驗。給藥前禁食12 h，自由飲水，經口服灌胃給予LBP-FITC，給藥劑量200 mg/kg（以體質量計），給藥容量1 mL/100 g。分別于灌胃給藥前及給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、48 h尾靜脈取血0.5 mL。將血樣采集到抗凝離心管中，3 000 r/min離心10 min，取上清液得到血漿，按1.3.3.3節條件測定熒光強度。

1.4 數據處理

利用藥代動力學WinNonlin軟件，采用非房室模型擬合大鼠單次口服LBP-FITC的經時血藥質量濃度數據，最大峰質量濃度（Cmax）及達峰時間（tmax）為實測值；藥時曲線下面積（area under the curve，AUC）、半衰期（t1/2）、總清除率（clearance，CL）、表觀分布容積（Vd）、平均滯留時間（mean residence time，MRT）等用統計矩參數。AUC反映藥物進入血循環的總量；t1/2表示藥物在體內分布達到平衡后，血漿藥物質量濃度消除一半所需的時間，是表達藥物在體內消除快慢的重要參數；CL表示單位時間內有多少分布容積中的藥物被清除，是估算藥物從體內消除速度的參數；MRT是指藥物分子滯留在體內的平均時間；Vd值表征藥物在體內被組織攝取的能力，表觀容積大的藥物體內存留時間較長。

2 結果與分析

2.1 血藥質量濃度標準曲線

所得線性回歸方程為y=1 378.7x—14.98（R2=0.998 9），血漿中LBP-FITC質量濃度在0.05～10 μg/mL范圍內與熒光強度線性關系良好，線性方程滿足代謝動力學的研究要求。

2.2 血漿精密度

表 1 大鼠血漿中LBP-FITC測定方法的日內精密度（n=5）Table 1 Inter-day precision of LBP-FITC in blank rat plasma ( n= 5)

表 2 大鼠血漿中LBP-FITC測定方法的日間精密度（n=5）Table 2 Intra-day precision of LBP-FITC in blank rat plasma (n= 5)

由表1、2可知，大鼠血漿中LBP-FITC質量濃度為0.1 μg/mL的5 個樣品日內RSD分別為5.28%、6.90%、3.17%、4.68%、4.90%，日間RSD為4.15%；質量濃度為1 μg/mL的日內RSD分別為6.41%、5.01%、4.91%、2.67%、5.39%；日間RSD為3.13%；質量濃度為10 μg/mL的日內RSD分別為3.86%、2.24%、3.28%、 2.48%、1.97%，日間RSD為2.62%。組內和組間的RSD都較小，證明該方法具有較好的精密度。

2.3 血漿回收率

表 3 大鼠血漿中LBP-FITC測定方法的回收率（n=5）Table 3 Recovery of LBP-FITC in rat plasma (n=5)

由表3可知，回收率在93.37%～95.72%之間，RSD分別為3.44%～4.62%，表明該方法具有良好回收率。

2.4 血漿穩定性

樣品在室溫放置24 h、反復凍融3 次和凍存15 d后的穩定性測定結果見表4，顯示RSD均較小，不大于5%，故含藥血漿在室溫條件下存放24 h、反復凍融3 次以及—20 ℃條件下貯存15 d的穩定性均良好。

表 4 大鼠血漿中LBP-FITC測定方法的穩定性結果（n=5）Table 4 Stability of LBP-FITC in rat plasma (n = 5)

2.5 大鼠單次口服LBP-FITC血藥質量濃度-時間曲線

圖 1 大鼠單次口服LBP-FITC的血藥質量濃度-時間曲線Fig.1 Plasma concentration-time profi le of LBP-FITC after oral administration

大鼠單次灌胃給予200 mg/kg LBP-FITC后，以測定的血漿藥物質量濃度對所對應的采血點作圖，獲得血藥質量濃度-時間曲線圖，見圖1。結果發現在灌胃后0.5 h就可在大鼠血漿中檢測出一定的熒光強度，表明0.5 h時LBP已吸收進入血液，1～2 h達到吸收高峰，之后隨著時間的延長血藥質量濃度逐漸減少，且速率逐漸減緩，直至48 h時仍能在血漿中測到熒光強度。

2.6 大鼠單次口服LBP-FITC的血漿藥代動力學參數

利用藥代動力學WinNonlin軟件，采用非房室模型擬合大鼠單次口服LBP-FITC的經時血藥質量濃度數據，計算得到主要藥代動力學參數見表5。

表 5 大鼠單次口服LBP-FITC的主要藥代動力學參數Table 5 Non-compartmental pharmacokinetic parameters of LBP-FITC after oral administration

如表5 所示，6 只動物的最大血藥質量濃度Cmax為（2.39±0.71） μg/mL；最大峰時間tmax為（1.17±0.41）h；AUC0-t為（45.85±7.12）（μg·h）/mL；AUC0-∞為（127.31±39.00）（μg·h）/mL；t1/2為（80.32±32. 70） h；CL為（1693.96±492.47） mL/kg；MRT為（20.64±1.36）h。

本研究中Cmax和t1/2值可說明LBP-FITC在大鼠體內的吸收迅速，但是消除緩慢，這可能與其高分子的性質有關。

3 討 論

近年來，天然多糖的研究越來越受到人們的重視，但是多糖在體內的代謝過程一直是人們所面臨的困惑。研究表明多糖可以以大分子形式吸收，但吸收率不高，有學者推測在大腸可能有部分多糖的代謝物-寡糖類被吸收，發揮吸收作用，產生類似與多糖的藥理作用，而剩余部分經大腸排泄[14]。但是多糖吸收后以何種方式存在，又是以什么形式發揮多重功效的，尚未有文章報道。代謝動力學研究可以揭示多糖在生物體內的吸收、分布、代謝及排泄的規律，并且也是闡明多糖及其代謝產物的藥理和毒理作用的物質基礎[15]。隨著科學技術的不斷發展，研究者也開始嘗試將同位素標記方法運用到多糖類物質的代謝動力學研究當中。謝炳華等[16]采用氚離子束標記茯苓聚糖，并口服灌胃小鼠以研究其在體內的藥代動力學。結果發現，藥物質量濃度-時間曲線屬于動力學雙室模型，消除半衰期較長（104 h），這可能是由于其高分子的性質所決定的。O′har[17]采用同位素標記法制備3H-香菇多糖，研究其在大鼠、小鼠和狗體內的藥代動力學。結果顯示，3H-香菇多糖在大鼠、小鼠和狗體內的分布沒有明顯區別，單次靜脈注射后血漿中的放射性強度逐漸減少，尿液和糞便中均能檢測出放射性；在肝臟和脾臟中也能檢測出放射性物質，但另一方面，腎臟和肺中的放射性強度迅速下降。陳群等[18]利用天青A與硫酸化多糖產生變色反應的特性，建立了大鼠血漿中茯苓多糖硫酸酯（pachyman sulfate，PS）的光譜檢測方法，同時測定了大鼠尾靜脈注射和腹腔注射PS后的血藥質量濃度，計算主要藥代動力學參數。結果發現PS的藥代動力學復合一房室、一級消除的開放模型，生物利用度為69.12%。

多糖結構復雜，缺少可見光、紫外光和熒光等光譜特征，體外檢測多是采用連接熒光檢測器或者蒸發光散射檢測器的高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）方法。但是由于體液成分較為復雜，使用HPLC方法時需要先進行去蛋白處理，易破壞多糖的結構，影響檢測效果，并且操作要求高，設備價格昂貴，因此同位素標記法進行多糖代謝研究結果有片面性和困難性[19]。有學者開始嘗試熒光標記多糖用于多糖代謝研究中。胡錦珍等[20]采用FITC對殼聚糖進行熒光標記得到產物為FITC-CIS，采用熒光分光光度計測定和HPLC分析相結合的方法發現小鼠口服FITC-CIS后主要分布在腎臟中，并以原型形式經糞便排出，部分分解的殼聚糖則從尿液排出，但是血清中的FITC-CIS質量濃度非常低，可能是具有較高分子質量的殼聚糖很難被吸收進入血液的緣故。謝華通等[21-22]同樣采用FITC標記麥冬多糖MDG-1得到F-MDG-1，采用熒光凝膠色譜法觀察多糖在大鼠胃腸道內的含量變化以及排泄變化。結果顯示，給予相同劑量的F-MDG-1，隨著在胃內停留時間的延長，其質量分數由99.65%下降到42.45%；給予不同劑量后，1 h的測得質量分數占給藥量的百分比隨著給藥劑量的增加而增加，考慮到胃酸的酸性pH值影響熒光響應值，將pH值調至7.2后含量并未變化，提示F-MDG-1在胃內不受環境以及蛋白酶的影響，在胃內不被分解。4 h后大腸和小腸中的測得量均有減少，數據結果表明MDG-1在腸道內分解，主要代謝部位在大腸。尿液和糞便中測定均在12 h時達到最大值，隨后逐漸減少。

本實驗采用熒光酶標儀測定血漿中的LBP-FITC的熒光強度以計算其中的藥物質量濃度。相比較于熒光分光光度計，熒光酶標儀檢測方法對生物樣品需求量少，僅需100～200 μL即可進行測定，節省生物樣品，且可同時測定多個樣品，操作方便。

目前對于方法學的考察確證主要包括對方法的選擇性、線性及范圍、精密度、回收率和樣品穩定性等方面的考察，要求測定5～8 個系列質量濃度的生物樣品來繪制標準曲線，并且標準曲線要覆蓋待測樣品的質量濃度范圍。另外樣品從采集到分析這一過程需經過很多步驟，保證樣品的穩定性是定量分析可靠的一個必要條件，因此在分析方法的建立過程中應充分了解樣品在分析操作過程中的穩定性。文獻[23]認為應首先考慮被測物在儲存條件下的可穩定性時間，其次考慮被測物在生物樣品中的穩定性，包括在室溫、冷凍貯存和反復凍融條件下的穩定性。故本研究對所建立的方法進行了線性、精密度、回收率及穩定性的考察，結果表明該檢測方法線性范圍較寬、靈敏度高、重復性好，生物樣品中的內源性雜質對測定不產生干擾，符合藥代動力學研究的指導原則以及生物樣品分析國際規范的相關要求，為進一步的多糖代謝動力學研究提供良好的檢測方法。

一直以來，由于多糖沒有準確靈敏的檢測方法，所以與藥效學相比，LBP等多糖類的代謝動力學研究鮮未報道。本研究利用已建立的檢測方法對大鼠單次口服LBP-FITC后的血漿代謝動力學進行初步研究。結果發現，在大鼠灌胃給予LBP-FITC后0.5 h就可在血漿中的檢測出一定的熒光強度，說明LBP在大鼠體內吸收較快。1～2 h達到吸收最大峰，之后隨著時間的延長血藥質量濃度逐漸減少，直至48 h時仍能在血漿中測到熒光強度。

本實驗建立了一種準確、靈敏且快速簡便的測定大鼠血漿中LBP-FITC的熒光檢測法，并應用該方法對大鼠單次口服LBP-FITC的大鼠代謝動力學展開了研究，可為以后多糖的功效機制研究提供良好的依據。

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Establishment of A Method for Detecting Fluorescence Labeled Lycium barbarum Polysaccharide in Rat Plasma

CHEN Chen1,2, TANG Huali1,3, MA Yue1, WANG Shaokang1, YANG Ligang1, PENG Jing4, SUN Guiju1,*
(1. Key Laboratory of Environmental Medicine and Engineering, Ministry of Education, Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009, China; 2. Wuxi Institute of Arts and Technology, Wuxi 214200, China; 3. College of Life Science and Engineering, Chongqing Three Gorges University, Chongqing 404000, China; 4. Tourism Institute, Yangzhou University, Yangzhou 225000, China)

A rapid and sensitive fl uorescent method was developed to determine fl uorescein isothiocyanate-labeled Lycium barbarum polysaccharides (LBP-FITC) in rat plasma. The linear calibration curve was obtained in the range from 0.05 to 10 μg/mL in rat plasma and the linear equation was y = 1 378.7x-14.98 (R2= 0.998 9). The inter-day coefficients of variation (CVs) at 0.1, 1.0 and 10 μg/mL of LBP-FITC were between 1.97% and 6.90%, and the intraday CVs at the three concentrations were between 2.62% and 4.15%. The recovery rates of LBP-FITC in rat plasma wer e between 93.37% and 95.72%. LBP-FITC was stable in rat plasma. The established method is suitable for LBP-FITC pharmacokinetic study. After oral administration of LBP-FITC to rats, the non-compartmental model was used to calculate the main pharmacokinetic parameters by WinNonlin software. The results of pharmacokinetic parameters indicated that the peak concentration (Cmax) was (2.39 ± 0.71) μg/mL, the time to reach the peak value (tmax) was (1.17 ± 0.41) h, the area under the curve (AUC0-t) was (45.85 ± 7.12) (μg·h)/mL, the AUC0-∞was (127.31 ± 39.00) (μg·h)/mL, the t1/2was (80.32 ± 32.70) h, the clearance (CL) was (1 693.96 ± 492.47) mL/kg, and the mean retention time (MRT) was (20.64 ± 1.36) h.

fl uorescein isothiocyanate-labeled Lycium barbarum polysaccharides (LBP-FITC); pharmacokinetics; stability; recovery rate

R151.3

A

1002-6630（2015）02-0090-06

10.7506/spkx1002-6630-201502017

2014-06-20

國家自然科學基金面上項目（81273069）；國家大學生創新性實驗計劃項目（1310286097）；

江蘇省高等學校大學生實踐創新訓練計劃項目（S2014116）

陳忱（1989—），女，助教，碩士研究生，研究方向為植物化學物與食品功效。E-mail：chen_chen0214@163.com

*通信作者：孫桂菊（1963—），女，教授，博士，研究方向為植物化學物與食品功效。E-mail：gjsun@seu.edu.cn