應(yīng)用單管半巢式PCR技術(shù)篩查轉(zhuǎn)基因食品

閆 偉，徐楨惠，龍麗坤，李蔥蔥，李飛武,*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，吉林 長春 130033；2.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150025）

應(yīng)用單管半巢式PCR技術(shù)篩查轉(zhuǎn)基因食品

閆 偉1，徐楨惠2，龍麗坤1，李蔥蔥1，李飛武1,*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，吉林 長春 130033；2.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150025）

建立轉(zhuǎn)基因作物中常見的兩種外源調(diào)控元件的單管半巢式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測方法，為轉(zhuǎn)基因食品的篩選檢測提供一種快速、精確的方法。針對6 種轉(zhuǎn)基因作物中CaMV35S啟動子和NOS終止子的一致性核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)巢式PCR的內(nèi)、外引物，在測試不同引物組合的擴(kuò)增效率基礎(chǔ)上，建立CaMV35S啟動子和NOS終止子的單管半巢式PCR方法。結(jié)果表明，上述方法對兩種轉(zhuǎn)基因成分具有良好的特異性，檢測靈敏度分別為0.01%和0.05%，顯著優(yōu)于常規(guī)PCR方法。該方法具有便捷、準(zhǔn)確、靈敏等特點(diǎn)，適合篩查食品中的轉(zhuǎn)基因成分。

轉(zhuǎn)基因食品；單管半巢式PCR；篩選檢測

近年來轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)呈現(xiàn)穩(wěn)步增長的態(tài)勢，2013年全球種植面積超過1.75億 公頃，涉及大豆、玉米、棉花、油菜、甜菜、番木瓜等多種作物[1]，絕大多數(shù)可直接作為食品/飼料或食品/飼料的加工原料。由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)可打破種間生殖隔離，具有一定的非預(yù)期效應(yīng)，社會公眾對轉(zhuǎn)基因食品的安全性一直存在爭議[2-3]。為此，許多國家對轉(zhuǎn)基因食品實(shí)行強(qiáng)制性標(biāo)識和安全監(jiān)管制度。

轉(zhuǎn)基因成分檢測為標(biāo)識和監(jiān)管制度的順利實(shí)施提供必要的技術(shù)手段，以外源核酸序列為檢測對象的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法是目前應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)基因成分檢測技術(shù)[4-5]，根據(jù)不同分類標(biāo)準(zhǔn)，PCR方法可細(xì)分為常規(guī)PCR、巢式PCR、多重PCR、定量PCR等[6-7]。巢式PCR利用2對引物、通過2 輪常規(guī)PCR可實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)序列的高特異性、高靈敏度擴(kuò)增，若巢式PCR的其中1條引物既做外引物，又當(dāng)內(nèi)引物，即只用1對半引物，則稱為半巢式PCR[8]。巢式或半巢式PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因作物的檢測中已有許多應(yīng)用[9-12]。

半巢式PCR一般以第1輪擴(kuò)增的產(chǎn)物作為第2輪擴(kuò)增的模板，存在操作繁瑣、成本增加、污染風(fēng)險加大等缺點(diǎn)[13]。單管半巢式PCR可通過內(nèi)外引物的特殊設(shè)計(jì)和退火溫度的不對稱設(shè)置，在同一反應(yīng)管內(nèi)完成2輪PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)序列的高特異性和高靈敏度檢測，在食品成分[14-15]和臨床檢測上應(yīng)用較為廣泛[16]。本研究以轉(zhuǎn)基因作物中常見的兩種外源調(diào)控元件CaMV35S啟動子和NOS終止子為靶標(biāo)檢測對象，旨在建立兩種篩選元件的單管半巢式PCR方法，為食品中轉(zhuǎn)基因成分的篩選檢測提供快速、精準(zhǔn)、高靈敏度、低成本的檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

轉(zhuǎn)基因玉米MON89034、Bt176、MON810，轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2，轉(zhuǎn)基因棉花MON531，轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1均為吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院保存的陽性參考物質(zhì)，非轉(zhuǎn)基因玉米購自市場。上述樣品中的外源調(diào)控元件信息見表1。

表 1 樣品中的外源調(diào)控元件信息Table 1 Description of exogenous regulatory elements in samples

新型植物基因組提取試劑盒（貨號DP320） 天根生化科技（北京）有限公司；HS Taq DNA聚合酶（貨號R007A）、DL2000 DNA Marker（貨號3427A）寶生物工程（大連）有限公司；瓊脂糖（貨號AB0014）生工生物工程（上海）股份有限公司；GeneFinder核酸染料（貨號204001） 廈門百維信生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5424型高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；ND1000紫外-可見光分光光度計(jì) 美國Thermo Fisher公司；C1000型PCR儀、GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取與純化

采用試劑盒方法提取樣品的基因組DNA，用ND1000紫外-可見光分光光度計(jì)測定樣品DNA的純度和質(zhì)量濃度，并用TE緩沖液將DNA稀釋至25 mg/L，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計(jì)

利用Vector NTI 11.5軟件對上述轉(zhuǎn)基因樣品中的CaMV35S啟動子和NOS終止子的核苷酸序列進(jìn)行同源性比對，以其一致性序列為模板，利用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)兩種外源轉(zhuǎn)基因成分的半巢式PCR檢測引物（表2），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用超純水稀釋至10 μmol/L，備用。

表 2 CaMV35S啟動子和NOS終止子的半巢式PCR和普通PCR檢測引物Table 2 Primers of semi-nested PCR and conventional PCR for CaMV35S promoter and NOS terminator

1.3.3 單管半巢式PCR檢測

CaMV35S啟動子：PCR體系中包括1×PCR緩沖液（含1.5 mmol/L Mg2+）、0.2 mmol/L dNTP，0.01 μmol/L正向外引物（P35S-WF）、0.2 μmol/L反向外引物（P35S-WR）、0.2 μmol/L正向內(nèi)引物（P35S-NF）、1.5 U HS Taq DNA聚合酶、50 ng樣品DNA，用超純水補(bǔ)齊25μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、72 ℃延伸40 s，10 個循環(huán)；94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

NOS終止子：PCR體系中包括1×PCR緩沖液（含1.5 mmol/L Mg2+）、0.2 mmol/L dNTP、0.2 μmol/L正向外引物（TNOS-WF）、0.01 μmol/L反向外引物（TNOS-WR）、0.2 μmol/L反向內(nèi)引物（TNOS-NR）、1.5U HS Taq DNA聚合酶、50 ng樣品DNA，用超純水補(bǔ)齊25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、67 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，10 個循環(huán)；94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

PCR結(jié)束后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4 常規(guī)PCR檢測

PCR體系中包括：1×PCR緩沖液（含1.5 mmol/L Mg2+）、0.2 mmol/L dNTP、0.2 μmol/L正向內(nèi)引物（NF）、0.2 μmol/L反向內(nèi)引物（NR）、1U HS Taq DNA聚合酶、50 ng 樣品DNA，用超純水補(bǔ)齊25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 ，35 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR結(jié)束后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測引物篩選

通過查閱數(shù)據(jù)庫、專利等文獻(xiàn)，獲得了表1所列的轉(zhuǎn)基因作物中的CaMV35S啟動子和NOS終止子核苷酸序列。為確保檢測方法具有更廣泛的適用性，利用生物信息學(xué)軟件Vector NTI 11.5對上述序列進(jìn)行同源性比對，并在最保守的序列區(qū)段設(shè)計(jì)引物，最終獲得了兩種篩選元件的半巢式PCR引物（表2），CaMV35S啟動子和NOS終止子的半巢式PCR的預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為206bp和175 bp。

單管巢式PCR既可在同一體系中加入2 條外引物和2 條內(nèi)引物（經(jīng)典的單管巢式PCR），也可只加入2 條外引物和1 條內(nèi)引物（改良的單管半巢式PCR）。本研究將這兩種策略的單管巢式PCR技術(shù)在CaMV35S啟動子和NOS終止子的檢測中進(jìn)行了應(yīng)用，結(jié)果表明，對兩種篩選元件，在采用1.3.3節(jié)所述的半巢式PCR體系時，獲得最優(yōu)的結(jié)果。

2.2 方法的特異性測試

以表1所列的實(shí)驗(yàn)材料作為測試對象，檢驗(yàn)CaMV35S啟動子和NOS終止子的半巢式PCR檢測方法的特異性。結(jié)果表明，應(yīng)用兩種篩選元件的半巢式PCR檢測方法均能從相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因材料中獲得與預(yù)期結(jié)果（表1）相一致的擴(kuò)增產(chǎn)物，見圖1。在CaMV35S測試體系中，MON531棉花樣品除了206 bp的預(yù)期產(chǎn)物外，還出現(xiàn)一條略小于500 bp的片段，經(jīng)分析，MON531采用了增強(qiáng)型啟動子，正向內(nèi)引物P35S-NF在MON531上有兩個結(jié)合位點(diǎn)，利用半巢式PCR方法理論上可獲得206 bp和467 bp兩個擴(kuò)增產(chǎn)物，與實(shí)際結(jié)果一致。表明本研究建立的檢測方法對兩種調(diào)控元件具有高度特異性。

圖 1 單管半巢式PCR方法的特異性Fig.1 Specifi city of the single-tube semi-nested PCR method

2.3 方法的靈敏度測試

以DNA質(zhì)量濃度均為25 mg/L的非轉(zhuǎn)基因玉米基因組DNA和MON89034玉米基因組DNA作為母液，采用基因組DNA梯度稀釋法，將MON89034玉米基因組DNA稀釋至MON89034 DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.02%、0.01%、0.005%的DNA測試樣品，對CaMV35S啟動子和NOS終止子的單管半巢式PCR方法的靈敏度進(jìn)行測試。結(jié)果表明，從0.01%及以上含量的測試樣品中獲得206 bp的CaMV35S啟動子的特異性產(chǎn)物，從0.05%及以上含量的測試樣品中獲得175 bp的NOS終止子的特異性產(chǎn)物，表明半巢式PCR方法對這兩種篩選元件的檢測靈敏度分別達(dá)到0.01%和0.05%（圖2）。為比較半巢式PCR與常規(guī)PCR的靈敏度，利用表2中的引物對上述樣品進(jìn)行常規(guī)PCR檢測，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為195 bp和171 bp，結(jié)果見圖3，CaMV35S啟動子和NOS終止子的常規(guī)PCR靈敏度分別為0.05%和0.1%。在本研究中，對兩種篩選元件來說，半巢式PCR方法的檢測靈敏度均顯著優(yōu)于常規(guī)PCR方法。

圖 2 單管半巢式PCR方法的靈敏度Fig.2 Sensitivity of the single-tube semi-nested PCR method

圖 3 普通PCR方法的靈敏度Fig.3 Sensitivity of the conventional PCR method

3 結(jié) 論

CaMV35S啟動子和NOS終止子作為已商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物中最常用的兩種調(diào)控元件，是目前食品中轉(zhuǎn)基因成分篩選檢測的主要對象[17-18]，研制這兩種轉(zhuǎn)基因外源成分的快速、靈敏、特異、低成本的檢測方法，可為轉(zhuǎn)基因食品檢測提供一種有效的技術(shù)手段。

研究表明，應(yīng)用半巢式PCR技術(shù)可獲得比常規(guī)PCR更高的檢測靈敏度，但經(jīng)典的半巢式PCR技術(shù)一般需進(jìn)行兩輪PCR，不僅操作繁瑣，還加大了污染的可能性[19]。本研究將較高退火溫度的外引物和較低退火溫度的內(nèi)引物一并放在PCR體系中，并采用先高溫退火、再低溫退火的熱不對稱PCR反應(yīng)程序[20]，可在同一管內(nèi)完成兩輪PCR擴(kuò)增，不僅操作簡便、成本降低，還能有效減少污染風(fēng)險。

序列分析表明，不同轉(zhuǎn)基因作物中應(yīng)用的CaMV35S啟動子和NOS終止子的核苷酸序列不盡相同，為保證檢測方法具有更廣泛的適用性，本研究在序列分析基礎(chǔ)上，選擇最保守的序列區(qū)段設(shè)計(jì)檢測引物，建立了兩種篩選元件的單管半巢式PCR方法。該方法對含有靶標(biāo)檢測對象的轉(zhuǎn)基因作物具有高度特異性，對CaMV35S啟動子和NOS終止子的檢測靈敏度分別達(dá)到0.01%和0.05%，顯著優(yōu)于常規(guī)PCR方法。此外，該方法還具有操作簡便、經(jīng)濟(jì)高效的優(yōu)點(diǎn)，具有很好的應(yīng)用前景。

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Screening of Genetically Modifi ed Foods by Single-Tube Semi-Nested PCR

YAN Wei1, XU Zhenhui2, LONG Likun1, LI Congcong1, LI Feiwu1,*
(1. Agro-Biotechnology Research Institute, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130033, China; 2. College of Life Science and Technology, Harbin Normal University, Harbin 150025, China)

A single-tube semi-nested PCR method for common exogenous regulatory elements of transgenic crops was established to provide a fast and accurate assay for screening genetically modifi ed foods. Two sets of element-specifi c nested PCR primers were designed based on the consensus sequence of the exogenous elements in six different transgenic crops, respectively. A single-tube semi-nested PCR assay for CaMV35S promoter and NOS terminator was developed by testing the amplifi cation effi ciency of different combinations of primers. This assay has been successfully applied to distinguish GM crops with CaMV35S promoter or NOS terminator from others with high specifi city. Sensitivity tests showed that the relative limit of detection for CaMV35S promoter and NOS terminator were 0.01% and 0.05%, respectively, signifi cantly better than those of conventional PCR. Consequently, the single-tube semi-nested PCR assay is convenient, accurate, sensitive and suitable for screening genetically modifi ed foods.

genetically modifi ed foods; single-tube semi-nested PCR; screening and detection

TS207.3

A

1002-6630（2015）02-0194-04

10.7506/spkx1002-6630-201502037

2014-04-02

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)（2014ZX08012-001）；吉林省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（2013）

閆偉（1984—），女，研究實(shí)習(xí)員，碩士，研究方向?yàn)檗D(zhuǎn)基因生物安全。E-mail：jlndyanwei@126.com

*通信作者：李飛武（1982—），男，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)檗D(zhuǎn)基因生物安全。E-mail：lifeiwu3394@gmail.com