不同時期鯧魚冷藏期間優勢腐敗菌的多樣性變化

藍蔚青，謝 晶*，周 會，張琛杰

（上海海洋大學食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201 306）

不同時期鯧魚冷藏期間優勢腐敗菌的多樣性變化

藍蔚青，謝 晶*，周 會，張琛杰

（上海海洋大學食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201 306）

目的：比較分析不同時期冷藏鯧魚（Pampus argenteus）貯藏期間的感官品質、pH值、微生物指標與主要微生物菌群的變化規律。方法：冷藏（4±1） ℃條件下，以感官評定、pH值與菌落總數為品質評價指標，采用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增結合生理生化鑒定法分別對冬、春兩個時期的鯧魚進行優勢腐敗菌的變化規律研究。將經細菌培養與分離純化得到單菌落按其形態特征進行分類，再通過生理生化鑒定與革蘭氏染色，初步得到菌落種類，對單菌落進行DNA提取與PCR擴增并測序。結果：冬季樣品獲得12 種菌株，春季樣品獲得9 種菌株。貯藏末期時，冬季樣品中優勢腐敗菌的種類與比例分別為嗜冷桿菌（Psychrobacter spp.）21.51%、草莓假單胞菌（Pseudomonas fragi）16.13%、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）52.68%與熱殺索絲菌（Brochothrix thermosphacta）9.68%；春季樣品為草莓假單胞菌（Pseudomonas fragi）8.62%、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）64.66%與腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）26.72%。結論：冬、春時期中冷藏鯧魚貯藏期間優勢腐敗菌的種類基本一致，以革蘭氏陰性菌為主，但在細菌種類與比例上存在差異，冬季樣品的微生物種類較春季豐富。貯藏期間，隨著熒光假單胞菌所占比例的增加，使腐敗希瓦氏菌的生長受到明顯抑制。

鯧魚；不同時期；冷藏；優勢腐敗菌；微生物多樣性

鯧魚（Pampus argenteus）屬鱸形目鯧科，主要分布于我國東海與南海區域，是季節性洄游的近海中下層魚類之一，為我國重要的魚類資源。鯧魚體內含有8 種人體所必需的氨基酸與不飽和脂肪酸，蛋白質含量達16.8%，且富含維生素（VA、VD、VB1、VPP）和礦物質，營養豐富[1]。

水產品由于受到溫度、酶、微生物、機械損傷與化學污染等多種因素的影響，在冷藏流通過程中鮮度極易下降，從而產生不可逆的腐敗變質現象。其中，微生物是導致多數水產品腐敗變質的主要原因。現有研究發現，腐敗過程中，只有極少種類的特定腐敗菌參與這一過程并產生不可接受的異味[2]，引起pH值變化、品質下降與產品腐敗，有毒有害物質隨之產生。這些適合生存、繁殖并產生腐敗臭味代謝產物的菌群就是該產品的特定腐敗菌[3]。特定腐敗菌的生長速度快于其他微生物，且腐敗活性強[4]。貯藏初期，其數量和種類并不占明顯優勢，但在貯藏期間，這些微生物易適應環境變化而大量繁殖，引起腐敗，在數量與比重上占絕對優勢，其他菌種所占比例明顯減少或不再繁殖。因此，如何延緩水產品的品質劣變，延長其貯藏貨架期，抑制由于微生物作用而引起的腐敗變質，現已成為科研工作者普遍關注的熱點。

近年來，國內外學者對引起水產食品腐敗變質的微生物開展了相關研究工作。崔正翠等[5-6]對大菱鲆在不同溫度貯藏過程中的細菌菌相進行定性和定量分析，并研究其細菌組成變化和優勢腐敗菌，結果得出大菱鲆在0～10 ℃冷藏過程中的優勢腐敗菌是腐敗希瓦氏菌，其次是假單胞菌。曹榮等[7-8]以養殖南美白對蝦、海捕鷹爪蝦與太平洋牡蠣為研究對象，對其貯藏過程中細菌總數和菌相變化進行研究，其中發現蝦類與牡蠣中的優勢腐敗菌也以假單胞菌為主。郭全友等[9-10]研究了冷藏羅非魚和養殖大黃魚的細菌組成、優勢腐敗菌及特征。張小偉等[11]對鯉魚冷藏過程中的鮮度和菌相進行了分析。楊憲時等[12]對冷藏羅非魚的細菌種群變化開展了研究。許鐘等[13]建立了羅非魚的特點腐敗菌生長動力學模型，并對其貨架期進行了預測。郭紅[14]、王凌燕[15]等分別對南美白對蝦在冰溫條件下的菌相變化和腐敗微生物開展了分析。王慶麗等[16]對養殖大黃魚和海水鱸魚冷藏過程中特定腐敗菌進行研究。以上研究結果也為本課題在后期開展鯧魚冷藏期間的優勢腐敗菌多樣性分析提供了基礎數據。本實驗主要以冬、春兩個時期的鯧魚作為原料，在進行感官評定、pH值與菌落總數比較分析的同時，同時采用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增結合生理生化鑒定法，研究不同時期鯧魚冷藏期間優勢腐敗菌的變化規律，為生鮮水產品的貯藏保鮮提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鯧魚（Pampus argenteus）購自上海蘆潮港海鮮批發市場，條質量0.25～0.50 kg。其中，冬季樣品（winter samples，WS）：采樣時間為2013年12月，春季樣品（spring samples，SS）：采樣時間為2014年3月。選擇這2 個時期分別進行樣品采集，并開展實驗研究。

胰蛋白胨大豆瓊脂培養基、胰蛋白胨大豆肉湯上海市疾病預防控制中心；革蘭氏染液與微生物生理生化微量鑒定管 杭州天和生物制劑有限公司；dNTP Mixture、10×PCR Buffer、TaqDNA酶 日本TaKaRa Bio株式會社；引物27f、1 492r、TAE電泳緩沖液（50×TAE）、Biospin細菌基因組DNA提取盒、6×Loading Buffer、Marker：λDNA /HindⅢ、100 bp DNA Ladder 生工生物工程（上海）有限公司。

DK-8D型電熱恒溫水槽、隔水式恒溫培養箱、DHG-9053A型電熱鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；MLS-3750高壓滅菌鍋 上海賽默科技生物發展有限公司；LDZX-75KBS 立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；VS-1300L-U型標準超凈工作臺蘇州安泰空氣技術有限公司；THZ-82A型氣浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市環宇科學儀器廠；MiniSpan Plue微型高速離心機 杭州奧盛儀器有限公司；Disrupter genie DNA混勻器、TC-24/H（b）型基因擴增儀 杭州博日科技有限公司；DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠；凝膠成像系統、ZEISS Scope A1. AXIO電子顯微鏡上海永傲精密儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料處理

選擇體型較大，色澤光亮，肉質較硬，無異味的新鮮鯧魚，魚樣捕撈上岸后即置于碎冰中，30 min內運至實驗室進行實驗。2 個采樣期內分別隨機選取新鮮鯧魚10 條，將樣品經“三去”（去頭、去尾、去內臟）處理，用冰水清洗后切塊，每份魚樣約質量40 g，分別置于保鮮袋中，在（4±1）℃冰箱中貯藏，隔天取樣后進行指標測定與微生物多樣性分析。

1.2.2 感官評定

根據鮮、凍鯧魚標準[17]采用5 分制評分法，由5 名專業人士組成的感官評定小組，分別從樣品的色澤、氣味、組織形態和彈性結構4 個方面綜合評分，結果取平均值。評分標準見表1，當樣品的評定綜合指標在3 分以下時，視為其初期腐敗的開始。

表 1 鯧魚感官評定表Table 1 Criteria for sensory evaluation of pomfret fi llets

1.2.3 pH值測定

取絞碎的魚肉5.00 g置于燒杯中，加入新鮮煮沸后已冷卻的蒸餾水，定容至50 mL，攪拌均勻，靜置30 min后過濾，測定濾液的pH值，平行測定3 次。

1.2.4 菌落總數測定

參照食品微生物學檢驗：菌落總數測定[18]的方法進行。選3 個合適的稀釋度，每個稀釋度3 組平行。樣品鮮度分類：一級鮮度：菌落總數≤104；二級鮮度：104≤菌落總數≤107。

1.2.5 菌株分離鑒定

通過純培養方法得到多個不同形態的單菌菌落，根據菌落外觀與菌體鏡檢形態對細菌初步分類，計算同一類型的菌落數量。

1.2.5.1 菌落與細胞形態觀察

對分離純化得到的單菌菌落進行菌落形態觀察與菌落計數，并結合革蘭氏染色與芽孢染色，觀察細胞形狀，對細菌進行初步分類，計算不同時期與貯藏時間的同一種類菌落數。選取菌落數在30～300 個的計數平板，隨機挑取不同種類的50 個典型單菌落，以平板劃線法分離純化3 次，得到的純菌株保存于試管斜面培養基上，以備鑒定。

1.2.5.2 分類保存

根據菌落特點與形態學特征，將在不同時期與貯藏時間挑選出的菌株依次作好標記，分組歸類，再進行純培養，重復以上比較。隨后將特征差異明顯的菌株重新分類標記，再予以純培養，重復操作3 次，分離得到純菌株，每一種純菌株作2 組平行，記錄其形態特征。

1.2.6 單細菌DNA提取與純化

將分離篩選后的純菌株分別接種到TSB中，在37 ℃、170 r/min的搖床中將其培養至對數生長期，然后吸取10 mL細菌培養液，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，棄上清液，將細菌—20 ℃保存，用于下一步提取DNA[19]。采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取純化菌株的DNA，同時增加溶菌酶破壁。提取出的DNA分別編號后在—20 ℃的冰箱中保存備用。

1.2.7 16S rDNA片段的PCR擴增

以提取的細菌基因組DNA為模板，選用細菌通用引物。正向引物：27f：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物：1492r：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。PCR擴增反應體系如表2所示。

表 2 PCR擴增反應體系Table 2 PCR Reaction system

反應步驟為：1）94 ℃熱啟動5 min；2）94 ℃預變性5 min；3）94 ℃變性1 min；4）57 ℃退火1 min；5）72 ℃復性2 min；6）72 ℃延伸10 min；重復步驟3）、4）、5）25 次[20]。通過1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR擴增產物，產物片段約為1 500 bp。使用DNA純化試劑盒對PCR產物進行純化，獲得的純化產物送生工生物工程（上海）有限公司測序。

1.2.8 系統發育樹分析

將測序得到菌株部分長度約1 460 bp的16S rDNA序列登錄至NCBI網站（http://www. ncbi. nlm.nih.gov/ blast/），獲得各自在GenBank數據庫中的臨時登錄號。通過BLAST程序與GenBank中的核酸序列進行同源性分析比對，選出相似性較高的序列，應用Chromas Version 1.62和DNAMAN Version 6.0軟件進行多重比較后構建系統發育樹。

1.2.9 生理生化鑒定分析

參照文獻[21-22]對分類篩選后的純菌株進行生理生化鑒定，并結合蔗糖、山梨醇、乳糖、麥芽糖、甘露糖、甘露醇、木糖、尿素等進行糖醇類發酵利用實驗，由培養后的顏色反應進一步判斷細菌種類。

2 結果與分析

圖 1 不同時期鯧魚冷藏期間的感官分值變化Fig.1 Changes in sensory evaluation scores of pomfret fi llets during chilled storage

2.1 感官評定由圖1可知，不同時期鯧魚樣品冷藏期間的感官分值呈總體下降趨勢，且變化規律基本相同，表明在同等流通環境下，樣品的感官品質變化與捕撈時期無關。新鮮鯧魚切面色澤正常，富有光澤，味道清新，肌肉組織肌理清晰，彈性良好。隨著貯藏時間的延長，魚體表面色澤逐漸暗淡，失去原有光澤，色澤變黃、發黏、軟且無彈性，有部分汁液流出，散發腥臭，紋理模糊，品質明顯下降，逐漸趨于腐敗。

2.2 pH值

圖 2 不同時期鯧魚冷藏期間的pH值變化Fig.2 Changes in pH of pomfret fi llets during chilled storage

由圖2可見，兩個時期鯧魚樣品貯藏期間的pH值呈先降后升的“V”形變化趨勢，主要由于是樣品捕撈上岸后，先后經歷了初期的生理生化變化、死后僵硬、解僵、自溶與腐敗的過程，pH值下降是由于水產品僵直過程中糖原的酵解和ATP分解產生乳酸、丙酮酸、磷酸等酸性物質。隨著魚體內蛋白酶分解釋放出氨及胺類物質，pH值開始上升。僵硬期間，樣品的pH值略有下降，自溶腐敗期間pH值持續升高[23]。pH值越高，說明樣品的腐敗程度相對越嚴重，鮮度和品質也隨之降低。通過對兩個時期樣品pH值變化情況的比較分析，可發現冬季樣品pH值的增長速度較緩。可能由于冬季時期的環境溫度較春季略低，使樣品死后各個時期的生理生化變化適當延后，從而延緩了鯧魚的腐敗進程。

2.3 菌落總數

圖 3 不同時期鯧魚冷藏期間的菌落總數變化Fig.3 Changes in TVC in pomfret fi llets during chilled storage

由圖3可知，兩個時期鯧魚樣品的菌落總數與感官分值的變化趨勢基本一致。魚樣均在冷藏的第4天超過國標規定的二級鮮度。貯藏的第6天，其菌落總數的對數值分別達到8.17±0.15和8.40±0.20。此時的魚肉色澤灰暗，光澤不再，流出汁液，有腥臭味散出，紋理不再清晰，魚體變軟，失去彈性，表明樣品已進入腐敗階段。到第8天時，樣品已完全腐敗。

2.4 細菌菌落形態分析

采用稀釋平板分離法和劃線分離法，經過3 次以上的比較分組與歸類計數，一共從2 個時期的鯧魚樣品冷藏期間分離出12 種典型菌，分別命名為X1、X2……X12，其菌落與細菌的基本特征見表3。

表 3 不同時期鯧魚冷藏期間的細菌菌落特征分析Table 3 Characteristics of bacterial colonies in pomfret fi llets during chilled storage

注：X1、X2……X12分別為12 株菌。2.5 菌株的16S rDNA基因序列分析

用正向引物27f和反向引物1 492r對兩組樣品中的優勢菌進行16S全長序列的PCR擴增，對產物進行電泳檢測，得到條帶穩定且重復性好，雜帶不明顯，片段長度約為1 500 bp，電泳圖譜如圖4所示。

圖 4 菌株的16S rDNA電泳圖譜Fig.4 Electrophoretic analysis of PCR amplifi cation products of 16S rDNA gene fragments

2.6 系統發育樹分析

將12 株分離細菌所獲得的16S rDNA序列提交NCBI，獲得其在GenBank數據庫中的臨時登錄號。通過BLAST軟件與GenBank中已發表的16S rDNA序列進行同源性比較分析，選取同源性多數在99%以上的8 個菌株進行比較，并構建系統發育樹，根據親緣關系遠近判斷細菌種類。其中，分別對主要優勢菌X3與X4繪制系統發育樹（圖5）。

圖 5 基于16S rDNA序列同源性的XX3與XX4菌株的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strains X3and X4based on 16S rDNA sequences

2.7 菌株的生理生化鑒定分析

不同時期的鯧魚樣品在冷藏貨架期結束時，菌相逐漸趨于簡單。其中冬季樣品貯藏末期的主要優勢菌為X1、X2、X3與X10，春季樣品貯藏末期的主要優勢菌為X2、X3與X4。通過對12 種主要優勢菌株的生理生化特征鑒定分析，其各項生理生化指標結果如表4所示。

表 4 不同時期鯧魚冷藏期間主要優勢菌的生理生化特征Table 4 Physiological and biochemical characteristics of dominant bacteria in pomfret fillets during chilled storage

通過在GenBank進行基因序列的相似性比對，結合菌株的生理生化特征分析，可判斷出X1為嗜冷桿菌屬（Psychrobacter spp.）中的一種，X2與X3分別為假單胞菌屬（Pseudomonas spp.）細菌，X4為希瓦氏菌屬（Shewanella spp.）中的一種，其余8 種菌均在PCR擴增測序結果比對的基礎上，結合生理生化鑒定與系統進化樹分析加以鑒別得出其各自屬種，可得X1為嗜冷桿菌（Psychrobacter spp.），X2為草莓假單胞菌（Pseudomonas fragi），X3為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens），X4為腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens），X5為成團腸桿菌（Enterobacter agglomerans），X6為腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus），X7為松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri），X8為微桿菌（Microbacterium esteraromaticum），X9為嗜根庫克菌（Kocuria rhizophila），X10為熱殺索絲菌（Brochot hrix thermosphacta），X11為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），X12為金黃色葡萄桿菌（Chryseobacterium spp.）。

2.8 不同時期鯧魚冷藏過程中的菌相組成變化

根據對不同時期鯧魚冷藏期間的菌株進行反復分離純化并鑒定分析，將不同時間的鯧魚樣品經反復分離純化與比較分類，并對典型菌株進行計數，計算其各自所占比例，結果如表5所示。

表 5 鯧魚在不同時期冷藏過程中的細菌組成與變化分析Table 5 Changes in bacterial proportion and composition of pomfret fillets during chilled storage

由表5可得，貯藏末期冬季樣品中優勢腐敗菌的比例為嗜冷桿菌（Psychrobacter spp.）21.51%、草莓假單胞菌（Pseudomonas fragi）16.13%、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）52.68%與熱殺索絲菌（Brochothrix thermosphacta）9.68%；春季樣品為草莓假單胞菌（Pseudomonas fragi）8.62%、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）64.66%與腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）26.72%，這與國內外部分學者的研究結果相一致。郭全友等[24]對養殖大黃魚的菌相分析結果表明腐敗希瓦氏菌和假單胞菌是低溫貯藏大黃魚的優勢腐敗菌。Gill等[25]認為假單胞菌屬和希瓦氏菌屬是冷鏈流通中高水分蛋白食品的特定腐敗菌。熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是水產品的主要條件致病菌與腐敗菌，當魚體因捕撈、貯運等過程中的人為操作不當或機械損傷等原因，魚體易被該菌侵入引起發病致腐[26]。胥亞夫等[27]研究證明水產品中常見的腐敗菌假單胞菌屬細菌主要為熒光假單胞菌、腐臭假單胞菌和邊緣假單胞菌。此外，課題組于貯藏末期在冬季樣品中未檢出腐敗希瓦氏菌，而在春季樣品中檢出少量。可能是由于較高濃度的熒光假單胞菌對腐敗希瓦氏菌的正常生長產生抑制[28]。

3 結 論

1） 2 個時期鯧魚的冷藏貨架期均為4 d，其中冬季樣品的初始新鮮度略優于春季樣品，這可能同樣品自身品質、季節洄游性特點與環境溫度條件直接相關；2）鯧魚的優勢腐敗菌主要為革蘭氏陰性菌，其中嗜冷桿菌（Psychrobacter spp.）、 假單胞菌（Pseudomonas spp.）與腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefacie ns）為主要優勢菌；革蘭氏陽性菌則以葡萄球菌（Staphylococcus spp.）與熱殺索絲菌（Brochothrix thermosphacta）為主；較高濃度的熒光假單胞菌對腐敗希瓦氏菌的正常生長產生抑制；3）冬季樣品組：初始階段中革蘭氏陰性菌所占比例明顯高于革蘭氏陽性菌，隨著貯藏時間的延長，革蘭氏陰性菌所占比例逐漸升高，并占絕對優勢，其主要由嗜冷桿菌（Psychrobacter spp.）、假單胞菌（Pseudomonas spp.）與熱殺索絲菌（Brochothrix thermosphacta）組成，其他菌群數量則隨之減少。說明不同微生物之間的相互作用可影響其生長和新陳代謝[2]。微生物間的相互作用使優勢菌的種類比例在腐敗期間不斷改變；4）春季樣品組：從初始至完全腐敗的過程中，革蘭氏陰性菌始終占有絕對比重。其中0 d的細菌組成比例與冬季樣品組有明顯區別，說明了在不同時期里，由于樣品自身品質、覓食條件與生活環境差異等原因，對鯧魚樣品的主要微生物種群分布產生影響。主要優勢菌為假單胞菌（Pseudomonas spp.）與腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）。兩個季節中主要腐敗菌的類型基本一致，但微生物種類與比例明顯不同，存在著不同微生物間相互影響的現象。

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Diversity of Dominant Spoilage Bacteria in Pomfret (Pampus argenteus) from Different Growing Seasons during Chilled Storage

LAN Weiqing, XIE Jing*, ZHOU Hui, ZHANG Chenjie
(Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Product Processing and Preservation, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Objective: Changes in the sensory and microbial quality, pH and dominant microflora of pomfret (Pampus argenteus) from different growing seasons (winter and spring)were investigated during chilled storage. Methods: Based on the results of sensory evaluation, pH and total viable count (TVC), the diversity of dominant spoilage bacteria in pomfret were monitored by the combination of PCR amplifi cation with physiological and biochemical identifi cation. After separation and purification of dominant spoilage bacteria in pomfret, the single colony types of bacteria were classified according to their morphological features, physio-biochemical identification, Gram staining, DNA extraction, PCR amplifi cation and sequencing. Results: Totally 12 strains of bacteria were obtained in winter samples (WS) and 9 strains of bacteria in spring samples (SS). The dominant spoilage bacteria in WS included 21.51% Psychrobacter spp., 16.13% Pseudomonas fragi, 52.68% Pseudomonas fluorescens and 9.68% Brochothrix thermosphacta, while those in dominant spoilage bacteria in spring samples (SS) included 8.62% Pseudomonas fragi, 64.66% Pseudomonas fl uorescens and 26.72% Shewanella putrefaciens. Conclusion: The species of dominant spoilage bacteria in pomfrets from both seasons during chilled storage were mainly composed of Gram-negative bacteria, the species and proportion of bacteria were different between the two seasons. Microbial species were more abundant in winter than those in spring. With the high proportion of Pseudomonas fl uorescens, the growth of Shewanella putrefaciens was inhibited obviously during chilled storage.

Pampus argenteus; different growing seasons; chilled storage; dominant spoilage bacteria; microbial diversity

TS254.4

A

1002-6630（2015）02-0226-06

10.7506/spkx1002-6630-201502044

2014-07-05

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD38B09）；上海市科技興農項目（滬農科攻字2013第3-4號）；

上海海洋大學科技發展專項

藍蔚青（1977—），男，高級工程師，博士，研究方向為水產品低溫保鮮技術。E-mail：wqlan@shou.edu.cn

*通信作者：謝晶（1968—），女，教授，博士，研究方向為水產品低溫保鮮技術。E-mail：jxie@shou.edu.cn