多孔利福平PLGA微球的制備工藝研究

欽富華，蔡 雁，趙黛堅

(1.浙江醫藥高等專科學校，浙江寧波 315100;2.浙江省寧波市第九醫院，浙江 寧波 315020)

抗結核藥在臨床防治結核病的過程中起著重要作用。目前該類藥物主要以口服或注射等全身給藥為主，普遍存在肝臟、胃腸道的不良反應。且因長期給藥導致多重耐藥結核分枝桿菌的出現，使肺結核疫情再度呈現惡化趨勢［1-3］。為了解決該問題，研究者提出抗結核藥物以吸入的方式給藥，經細支氣管—肺途徑將藥物直接輸送至靶部位，提高藥物療效，降低不良反應及耐藥性的產生。其中生物可降解的微球被認為是具有良好前景的吸入給藥載體。

采用生物可降解材料制備的微球具有良好的生物相容性和藥物釋放性能，常用的材料包括殼聚糖、聚乳酸(polylactic acid，PLA)、聚乳酸—羥基乙酸共聚物［poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA］等［4-6］。要使藥物有效地到達靶部位，必須提高微球在肺部的沉積率，傳統的實心微球因空氣動力學性質不適宜而大部分滯留于口咽部，達到肺部的量有限。因此，研究人員設計了低密度多孔PLGA微球(密度小于0.4 g·cm-3，平均幾何粒徑大于5.0 μm)［7］，并證實其不僅提高了肺部的沉積且減少了肺部巨噬細胞的吞噬。近年來，多孔微球成為肺部給藥系統研究的熱門載體［8-9］。本研究采用利福平(rifampicin，RFP)為模型藥物，生物可降解的PLGA為載體材料，對多孔微球的制備工藝進行考察。低密度多孔PLGA微球或可成為新的遞送載體，提高利福平的肺靶向性，增加其抗結核療效并降低毒副作用。

1 儀器與試藥

Dionex U3000高效液相色譜儀(美國戴安公司);掃描電子顯微鏡(日本日立公司);電子分析天平(梅特勒—托利多儀器有限公司);XSP-8CA生物顯微鏡(上海光學儀器廠);Scientz-10N冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司);JY 92-ZD超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

利福平原料(上海金穗生物科技有限公司，批號JS10801);利福平對照品(中國食品藥品檢定研究院，110757-200206);PLGA 75∶25，PLGA 50∶50(山東醫療器械研究所);碳酸氫銨(上海試四赫維化工有限公司);甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 乳化溶劑擴散法多孔RFP/PLGA微球的制備［10］稱取一定量的NH4HCO3溶于0.1%聚乙烯醇(PVA)溶液作為內水相;另稱取500 mg PLGA和50 mg RFP溶于適量二氯甲烷中作為有機相;將1 mL內水相加入到有機相中，短時探頭超聲成初乳，冰浴冷卻后加入到外水相25 mL一定濃度的PVA溶液中，高速均質1 min成復乳，將復乳轉移至200 mL 0.5%的PVA溶液中，低速(300 rpm)攪拌4 h使溶劑揮發，微球固化完全，離心收集微球，水洗后冷凍干燥24 h即得。

2.2 微球粒徑及表面孔徑的測定 光鏡下隨機計數200個微球的粒徑，計算其平均值。采用掃描電子顯微鏡觀察微球的表面形態，記錄同一批球中5個微球表面孔道直徑，取平均值，計算得到平均孔徑。

2.3 微球包封率的測定 取微球約20 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜過濾后HPLC法測定微球中的藥物含量。包封率=(微球中藥物測得量/微球理論載藥量)×100%。

色譜條件:Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱;乙腈—0.075 mol·L-1KH2PO4溶液(40∶60)為流動相;檢測波長為254 nm;流速1 mL·min-1，柱溫 30℃，進樣量 20 μL。

2.4 單因素考察對微球表觀形態及包封率的影響

2.4.1 PLGA種類的影響 固定PLGA的濃度、發泡劑濃度、均質速度和外水相PVA濃度，分別采用PLGA 75∶25和 PLGA 50∶50 制備載藥多孔微球，考察微球的形態和包封率。結果見表1和圖1。

表1 PLGA種類對微球表觀形態及包封率的影響

結果表明，采用不同的PLGA種類制備的微球在表面形態上有差異。以PLGA 75∶25為材料制備的微球孔道結構呈蜂窩狀，內部和表面分布比較均勻，而采用PLGA 50∶50制備的微球則多為內部中空，且孔道尺寸相對較大。其原因可能是兩種材料自身在密度及溶解后有機相的黏度大小上存在差異，導致氣泡的聚集和逸出的速度不同。相比較而言，采用PLGA 75∶25制備的微球粒徑和孔道尺寸更為均勻，因此后續考察均采用PLGA 75∶25為材質。

2.4.2 PLGA濃度的影響 固定發泡劑濃度、均質速度和外水相PVA濃度，考察不同的PLGA濃度對微球形態和包封率的影響，結果見表2和圖2。

表2 PLGA濃度的影響結果

結果顯示，微球的粒徑隨PLGA濃度的增加而增大，而表面孔徑則變小。其原因主要是PLGA濃度增大，有機相的黏度變大，乳化分散的難度加大，同時氣泡聚集和逸出的速度降低;PLGA濃度過低或者過高均影響微球的圓整性，過低微球難以支撐而破碎，過高則不圓整。隨著PLGA濃度的增加，微球的包封率也相應增大，可能是所制備的微球比表面積減小，藥物的擴散量減小，故包封率提高。但綜合微球的形態和表面孔道的分布情況，本研究確定PLGA的濃度為10%。

2.4.3 發泡劑濃度的影響 固定PLGA濃度、均質速度和外水相PVA濃度，考察不同的發泡劑濃度對微球形態和包封率的影響，結果見表3和圖3。

表3 發泡劑濃度的影響結果

結果顯示內水相發泡劑濃度增加，微球粒徑變化不大，孔道則明顯增大。發泡劑濃度是影響微球多孔性的最主要因素，發泡劑濃度過低，孔道不明顯，但濃度也不宜過大，否則會導致微球整體結構塌陷。實驗中采用5%的NH4HCO3制備得到的微球已有部分呈現坍塌狀態。因此本研究選擇了3%的發泡劑濃度，微球的整體和孔道結構均較為理想。

2.4.4 均質速度 固定PLGA濃度、發泡劑濃度和外水相PVA濃度，考察不同的均質速度對微球形態和包封率的影響，結果見表4和圖4。

表4 均質速度的影響結果

結果顯示，均質速度主要影響微球的粒徑大小，均質速度越大，微球粒徑越小。同時實驗過程中發現，均質速度達到一定程度后，微球粒徑的大小變化不明顯。均質速度同時也影響表面孔道的形成，速度越快，發泡劑的發泡速度和氣泡的逸出也越快，孔道因此越明顯。

本研究主要以制備密度小于0.4 g·cm-3，平均幾何粒徑大于5.0 μm的微球粒子為目標，經后續相應參數的測定，選定均質速度為10 000 rpm。

2.4.5 外水相PVA濃度的影響 固定 PLGA濃度、發泡劑濃度和均質速度，考察不同的外水相PVA濃度對微球形態和包封率的影響，結果見表5。

表5 外水相PVA濃度的影響結果

結果表明，隨著PVA濃度的增加，微球的粒徑有減小趨勢，但變化不明顯;表面孔徑影響不大，但也有減小的傾向。綜合考慮，本研究確定外水相PVA的濃度為2%。

2.5 多孔RFP/PLGA微球的制備工藝確定 根據上述單因素考察結果，確定多孔微球的優化工藝條件如下:PLGA濃度為10%、發泡劑濃度為3%，均質速度為10 000 rpm，外水相PVA濃度為2%。將按上述條件制備的多孔微球進行相關參數的測定和體外釋放行為的考察，結果見表6和圖5。結果顯示所制備的多孔微球具有較低的密度和適宜的空氣動力學直徑，有利于微球沉積于肺的較深部位，且微球具有較高的初始釋放速率和持續釋放能力。

表6 多孔微球的相關參數

3 討論

目前多孔PLGA微球的制備方法包括乳化溶劑擴散法、相分離法、噴霧干燥法、超臨界流體技術等，其中以乳化溶劑擴散法最為常用。該法制得的微球形態圓整，粒徑分布均勻，藥物的包封效率高。在多孔微球的制備過程中常需加入致孔劑來形成微球的多孔結構，以NH4HCO3效果最佳，微球結構圓整，孔道結構明顯且包封率較高。因此本研究選擇NH4HCO3為發泡劑，乳化溶劑擴散法制備多孔PLGA微球。

吸入微球的空氣動力學直徑大小是影響藥物在呼吸道及肺部的沉積的重要因素之一，是影響藥效發揮的關鍵因素，常用質量平均空氣動力學直徑來表征。測定方法包括現代光學儀器法、飛行時間空氣動力學粒徑分布測定法和慣性撞擊器法等［11］。其中慣性撞擊器法利用慣性撞擊的原理，按粒徑大小將微球分級，能對空氣動力學直徑在不同大小范圍內的微球予以定量，是目前最常用、最經典的方法。但其測定需要專用的撞擊器，本研究因缺乏相應設備，采用了測定微球密度和粒徑大小，再根據經驗公式進行計算的方法進行代替［12］。空氣動力學直徑da=dg，其中ρ是實際粒子密度，dg是實際粒子的幾何平均粒徑。

目前肺吸入緩釋制劑的釋放曲線尚未有統一的標準，本研究在查閱文獻的基礎上［13-14］，采用膜透析法考察了多孔微球的體外釋放行為。具體操作為:取微球約20 mg，置透析袋中，加1 mL pH 7.4的PBS;將透析袋扎緊后置試管中，加入10 mL pH 7.4的PBS作為釋放介質，37℃恒溫振搖(100 r·min-1);定時取樣10 mL，立即補充等量新鮮釋放介質。樣品經微孔濾膜過濾后HPLC分析，計算累積釋放率并繪制釋放曲線。結果顯示多孔微球的初始釋放速度較快，24 h可達60%左右，后續釋放平緩。其原因可能是初始釋放以擴散為主，多孔微球的比表面積大，釋放快;后期以PLGA的生物降解為主，藥物釋放速度慢。這種釋放行為即可使藥物在靶部位快速達到有效濃度，又能緩慢釋放藥物，維持更長的作用時間。

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