大孔型離子交換樹脂分離純化右旋糖酐酶

黎志德，常國煒，黃曾慰，曾練強，梁達奉

（廣州甘蔗糖業研究所 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東廣州 510316）

大孔型離子交換樹脂分離純化右旋糖酐酶

黎志德，常國煒，黃曾慰，曾練強，梁達奉*

（廣州甘蔗糖業研究所 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東廣州 510316）

本試驗使用大孔型離子交換樹脂對來源于重組畢赤酵母的右旋糖酐酶進行分離純化，結果表明：D151離子交換樹脂能有效地吸附右旋糖酐酶，靜態吸附4 h后，酶的吸附率達到53%，24 h后，吸附率達到95%；動態洗脫實驗離子交換樹脂可以分離酶蛋白和雜蛋白，酶的比活力提高2.43倍，但酶的回收率較低，只有8%。

右旋糖酐酶；大孔型；離子交換樹脂；右旋糖酐酶

0 前言

右旋糖酐酶(Dextranase)可以專一性水解α-1,6-糖苷鍵，將右旋糖酐水解成小分子的寡聚糖[1]。右旋糖酐酶適合在制糖生產中使用，加入0.05 U/mL的右旋糖酐酶即可將蔗汁中濃度為800～900 mg/(kg·°Bx)的右旋糖酐完全去除[2]。同時，右旋糖酐酶在甘蔗亞硫酸法制糖[3]和原糖精煉[4]的應用性試驗中均有良好的效果，可見該酶具有在工業上應用的潛力。所以，尋找一種簡單易行的方法對右旋糖酐酶進行一定程度的純化，去除多余的菌體、營養成分以及色素等雜質，避免在長時間常溫存放時性狀變壞[5]就顯得十分有意義。離子交換樹脂作為一種常用的分離材料，可用于分離短肽和蛋白質等，例如溶菌酶[6]、乳糖酶[7]、乳鏈球菌肽[8]。其中，Cheigh[9]等使用離子交換樹脂實現一步純化Nisin短肽。加入異丙醇到流動相對離子樹脂柱進行線性梯度洗脫，可以迅速分離多種標準蛋白[10]。本文主要探討離子交換樹脂在純化右旋糖酐酶上應用方式，并對純化效果以及效率進行了研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

ZK11重組畢赤酵母發酵右旋糖酐酶酶液（廣州

甘蔗糖業研究所）；標準葡聚糖T-2000（美國法瑪西亞公司）；檸檬酸，3,5-二硝基水楊酸（國藥集團化學試劑有限公司）；硫酸鎂，硫酸銨，磷酸氫二鈉，硫酸銨，95%酒精，無水亞硫酸鈉，酒石酸鉀鈉，氫氧化鈉，苯酚（均為分析純，廣州化學試劑廠）；離子交換樹脂D301K、D380、D303、001X7、D151、D152（華東理工大學上海華震科技有限公司）。

1.2 實驗設備

AL104電子分析天平（美國Mettler公司）；Himac CR22GⅡ冷凍高速離心機（日本Hitachi公司）；Model7581型恒流泵（美國MasterFlex公司）；Vivaflow 200 PES 10000超濾膜（德國Sartorius公司）；SUKUN SKY-2102C搖床培養箱（寧波海曙賽福實驗儀器廠）；DK-S24型電熱恒溫水浴箱（上海精宏實驗設備有限公司）；2800型紫外-可見分光光度計（美國Unico公司）；BSZ-40自動部分收集器，BT100-2數顯恒流泵（上海滬西分析儀器廠有限公司）；電爐、移液槍、槍頭、比色管等。

2 實驗方法

2.1 酶液的前處理

將硫酸銨晶體研磨至粉末狀，添加至酶液中溶解，4℃下靜置過夜；取出，以12000 r/min離心10 min，分別測定上清液和沉淀物的酶活和蛋白濃度，計算出酶提取率和蛋白的總回收；按照酶提取率和蛋白回收率，選擇沉淀效果最佳的硫酸銨飽和度。

將沉淀后的蛋白用pH 5.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液溶解，再用孔徑為10 kDa的超濾膜進行脫鹽濃縮，并除去大部分分子量小于10 kDa的雜蛋白以及其他小分子雜質，置于4℃保存備用。酶活測定方法按DNS法，蛋白濃度測定按考馬斯亮藍G-250法[11]。

酶活定義：每分鐘在標準右旋糖酐底物T-2000中釋放出1 μmol還原糖所需的酶量為1個酶活單位，以U表示。

2.2 離子交換樹脂的預處理

離子交換樹脂先用飽和食鹽水充分浸泡，然后逐步降低浸泡液中的食鹽濃度直到零，酸型樹脂先用1 mol/L NaOH溶液浸泡，再用1 mol/L鹽酸浸泡，清洗至中性后常溫保存備用；堿型樹脂先用1 mol/L鹽酸浸泡，再用1 mol/L NaOH溶液浸泡，同樣清洗至中性后常溫保存備用。

2.3 離子交換樹脂的初步篩選

取按2.1節處理后的右旋糖酐酶酶液，分別加入50 mg/mL的離子交換樹脂D301K、D380、D303、001X7、D151、D152，置于恒溫搖床，16℃、100 r/min吸附12 h，去掉清液，用與酶液等體積，濃度為100 mg/mL的氯化鈉溶液進行洗脫1 h，分別測定各樣本洗脫液的A280nm值，計算出洗脫液中右旋糖酐酶回收率和蛋白回收率，選出效果最優的2種離子交換樹脂。其中280 nm為蛋白特征吸收波長，A280nm值常被用于層析分離中流動相蛋白含量的快速測定[12]。

2.4 樹脂用量對右旋糖酐酶靜態吸附效果的影響

取2.1節處理后的右旋糖酐酶酶液，加入100、200、300和400 mg/mL從2.3節中篩選出的樹脂，置于恒溫搖床，16℃、100 r/min吸附1 h，去掉清液，加入等體積的10 mg/mL氯化鈉溶液進行洗脫，分別測定加入樹脂后的pH，各樣本洗脫液的A280nm值，并計算出洗脫液中右旋糖酐酶回收率和蛋白回收率，選出最優的樹脂及其用量。

2.5 吸附時間對右旋糖酐酶靜態吸附效果的影響

取按2.1節處理后的右旋糖酐酶酶液，選擇按2.4節中選出的最適用量加入離子交換樹脂，置于恒溫搖床，16℃、100 r/min進行吸附反應，在1、2、4、8、24 h后各取1次清液，測定清液中剩余的酶活，計算出酶的吸附率，選出最佳靜態吸附時間。

2.6 鹽溶液種類對洗脫效率的影響

取按2.5節中吸附后的離子交換樹脂，用原酶液一半體積的100 mg/mL濃度的氯化鈉、硫酸鎂和硫酸銨溶液進行洗脫，置于恒溫搖床，16℃，100 r/min洗脫1 h，取出各樣本清液，測定清液中的酶活，計算出鹽溶液的洗脫率，選出最佳的鹽溶液。

2.7 洗脫鹽溶液濃度對洗脫效率的影響

取出按2.5節吸附后的離子交換樹脂，以原酶液體積的一半，加入100、200、300 mg/mL濃度的鹽溶液進行洗脫，置于恒溫搖床，16℃、100 r/min洗脫1 h，取出各樣本清液，測定清液中的酶活，計算出鹽溶液的洗脫率，選出最佳的鹽溶液濃度。

2.8 洗脫時間對洗脫效率的影響

2.9 離子交換樹脂動態洗脫純化右旋糖酐酶

在長1 m、內徑2.4 cm的玻璃層析柱中，裝入經過預處理的樹脂約150 mL，靜置一段時間后確定無氣泡和斷層后，放入略小于層析柱內徑的濾紙片保護床面。當樹脂床表面僅余1 mm液層時，吸取10 mL經預處理樣品，小心注入層析柱樹脂床中央，待大部分樣品進入樹脂床后，加入大約1 cm高的蒸餾水，打開層析柱下端閥門，再小心加入約5 cm高的100 mg/mL NaCl洗脫液，開啟恒流泵，流速為1 Bv/h，部分收集器收集時間為每管5 min，總收集時間為2 h。

3 結果與分析

3.1 硫酸銨沉淀右旋糖酐酶

按2.1用硫酸銨沉淀右旋糖酐酶，在不同飽和度下，右旋糖酐酶液酶提取率和蛋白提取率見圖1。

圖1 硫酸銨沉淀純化右旋糖酐酶

從圖中可以觀察到，在硫酸銨飽和度為25%時，酶以及雜蛋白都沒有沉淀，當飽和度上升至40%時溶液中的蛋白逐步沉淀下來，當飽和度到80%時酶和總蛋白提取率基本上一致，飽和度繼續上升，酶的提取率上升很少，而總蛋白的提取率則明顯上升，因此以80%飽和度作為沉淀條件是比較合適的。

表1 離子交換樹脂的初步篩選

3.2 離子交換樹脂的初步篩選

弱堿型離子交換樹脂D301K、D380、D303、強酸型離子交換樹脂001X7、弱酸型離子交換樹脂D151、D152靜態吸附12 h后洗脫結果如表1。

從表1觀察到右旋糖酐酶酶液經過離子交換樹脂的吸附后，D301K洗脫液的蛋白濃度最高，但酶活回收率沒有相應程度的提高，證明洗下來的雜蛋白比較多；D303和D151洗脫液在蛋白濃度較高的情況下，酶活回收率也很高。此外，強酸型離子交換樹脂001X7樣本有變渾濁且出現不溶物的現象，測定后發現離子交換吸附過程中pH下降幅度大，導致部分蛋白變性失活[5]，因此洗脫液中蛋白濃度出現明顯下降。綜合考慮，選取吸附效率相對較高的弱堿型離子交換樹脂D303和弱酸型離子交換樹脂D151繼續下一步實驗。

從來都是聽當媽的自說自話：“她長大了會感謝我的……”這是我第一次從一個孩子嘴里聽到真誠的驗證，這終于給一直糾結要不要當虎媽的我找到了一個理由。

3.3 樹脂用量對右旋糖酐酶靜態吸附效果的影響

以不同用量的D303和D151對右旋糖酐酶吸附4 h，吸附后用稀鹽水進行洗脫，測定洗脫液各項參數見表2和表3。

從表2可知D303用量上升時，溶液pH也隨之上升（酶液自身pH在5.5左右），但是右旋糖酐酶在中性偏堿性的環境下并不穩定[11]。

表2 離子交換樹脂D303靜態吸附右旋糖酐酶

表3 離子交換樹脂D151靜態吸附右旋糖酐酶

當D303加入量超過300 g/L時，pH上升幅度已影響了酶蛋白的穩定，洗脫液中可測得的蛋白濃度出現了下降，酶蛋白回收率也同樣降低，證明已有酶蛋白變性失活。D151由于本身是弱酸性的離子交換樹脂，隨著用量的增多引起的pH變化并不大，依然維持偏弱酸的條件，有利于酶蛋白的穩定，因此D151、D303最佳用量分別為400、200 mg/mL。此外，洗脫液透明澄清，去除了原來大部分的色素以及有氣味的雜質。

3.4 吸附時間對右旋糖酐酶靜態吸附的影響

右旋糖酐酶酶液中加入200 mg/mL D303和400 mg/mL D151離子交換樹脂進行靜態吸附，在不同時間點取樣測定上清剩余酶活變化趨勢見圖2。

圖2 吸附時間對右旋糖酐酶靜態吸附效率的影響

從圖2可以觀察到D151樣本吸收的酶蛋白較D303多，而且在5 h時已經吸附了80%以上的酶蛋白，到24 h時，清液中的剩余酶活已經不足5%。同時，D303樣本中剩余酶活還有50%以上，總體的吸附效率比D151要低。

3.5 洗脫鹽溶液種類對靜態洗脫效率的影響

以不同種類的鹽溶液對D151樹脂洗脫效果見表4。

表4 離子交換樹脂D151靜態吸附右旋糖酐酶

以不同濃度的鹽溶液對已吸附了右旋糖酐酶的樹脂進行洗脫，取樣后計算出酶回收率，洗脫效果見圖3。從表4中可以看到，硫酸鎂和硫酸銨溶液并不能有效、專一地將目標酶蛋白洗脫，因此氯化鈉溶液為最佳方案。

3.6 洗脫鹽溶液濃度對洗脫效率的影響

圖3 鹽溶液濃度對洗脫效率的影響

從圖3可以看到NaCl濃度超過200 g/L后，洗脫液中酶的回收率出現了下降。當使用飽和氯化鈉溶液進行洗脫時，可以觀察到洗脫液中少量沉淀出現。另外，考慮到后續脫鹽操作，洗脫液的鹽濃度不宜過高，定在最低的200 g/L濃度進行洗脫也是合適的。

3.7 洗脫時間對洗脫效果的影響

使用200 g/L濃度的NaCl溶液對吸附右旋糖酐酶后的樹脂進行洗脫，按照時間點進行取樣后，計算出酶回收率，結果如圖4。

圖4 吸附時間對右旋糖酐酶靜態吸附效率的影響

如圖4所示，洗脫時間的加長，對提高酶的回收率沒有明顯的幫助，因此靜態洗脫條件控制在1 h為宜。

3.8 離子交換樹脂動態洗脫純化右旋糖酐酶

按照2.8步驟所述，收集24管樣本后，測A280nm并記錄，所得洗脫曲線如圖5。

圖5 離子交換樹脂動態洗脫右旋糖酐酶

從圖5中可以觀察到，在第4、5、6管中存在一個大的吸收峰，在第13管中也存在一個小的吸收峰，經過酶活測定，只有第1個吸收峰有酶解反應，說明此吸收峰為目標峰。取第4管的樣本進行SDS-PAGE電泳檢測，結果為單一條帶，分子量大致在66 KDa，與此前電泳結果相符（圖6）。

總結前述實驗步驟，以取100 mL右旋糖酐酶發酵液進行實驗，初始酶活為10967.47 U/mL，比活力為8767.11 U/mg，經過硫酸銨沉淀，超濾膜脫鹽以及樹脂動態洗脫，回收率見表5。

4 結論

綜上所述，D151大孔型離子交換樹脂在純化右旋糖酐酶上有明顯效果，不僅體現在操作前后溶液中比活力的上升以及優秀的吸附性能，而且在除去發酵液中帶來的異味和雜色也有相當好的效果。同時，本實驗使用的工程菌株為組成型表達同時使用無機培養基進行培養，發酵液離心分離后即可獲得酶蛋白較高的原始酶液，方便后續處理。存在的問題是常用于離子交換樹脂洗脫的氯化鈉溶液，不能完全把吸附在樹脂的酶蛋白重新洗脫出來，靜態吸附中回收率不到60%，動態吸附中則進一步降低。

圖6 SDS-PAGE檢測

表5 右旋糖酐酶的回收率

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(本篇責任編校：朱滌荃)

Separation and Purification of Dextranase with Macroporous Ion Exchange Resin

LI Zhi-de, CHANG Guo-wei, HUANG Zeng-wei, ZENG Lian-qiang, LIANG Da-feng
(Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute/Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement & Biorefinery, Guangzhou 510316)

Dextranase from recombinant Pichia pastoris was separated and purified by macroporous ion exchange resin. Results show that dextranase can be absorbed by D151 effectively. Dextranase absorption rate is 53.51% after four hours of static adsorption, it will be 95% after twenty-four hours. D151 is able to separate dextranase and hybridprotein. Specific activity of dextranase is 2.43 times after dynamic elution purification, but the recovery rate of dextranase is only 8%.

Dextranase; Macroporous; Ion exchange resin; Dextranase

TS24

A

1005-9695(2015)04-0058-07

2015-06-16；

2015-08-01

八桂學者建設工程專項、現代農業產業技術體系建設專項經費資助

*通訊作者：梁達奉(1964-)，男，博士，教授級高級工程師，國家甘蔗產業技術體系崗位科學家，主要研究方向：制糖生物技術；

E-mail: ldfjt@126.com

黎志德，常國煒，黃曾慰，等. 大孔型離子交換樹脂分離純化右旋糖酐酶[J]. 甘蔗糖業，2015(4)：58-64.