生物絮凝劑的制備及其在蔗汁澄清的應用探索

李雨虹，曾練強，馬 步，鐘志才，常國煒，黎志德，徐艷芳，梁達奉,

（1廣州甘蔗糖業研究所 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東廣州510136；2廣西糖業研發中心，廣西南寧530002；3廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530004）

生物絮凝劑的制備及其在蔗汁澄清的應用探索

李雨虹1，曾練強1，馬 步2，鐘志才1，常國煒1，黎志德1，徐艷芳3，梁達奉1,2

（1廣州甘蔗糖業研究所 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東廣州510136；2廣西糖業研發中心，廣西南寧530002；3廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧530004）

以地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)為出發菌株，通過紫外誘變選育出一株產絮凝劑的高效菌株，經過搖瓶發酵生產生物絮凝劑(MBF)對甘蔗中和汁進行澄清試驗。結果表明，突變株比出發菌株產MBF的絮凝活性提高17%；10 U/mL 的MBF與2 mg/kg聚丙烯酰胺(PAM)處理甘蔗中和汁澄清效果相當。MBF取代PAM作為糖用絮凝劑具有可行性。

紫外誘變；生物絮凝劑；甘蔗中和汁；澄清

0 引言

蔗汁澄清是制糖工藝中的關鍵環節，絮凝劑在其中起著重要的作用。我國的制糖工業在上世紀60年代后期開始在蔗汁澄清中采用高分子聚合物作絮凝劑，目前國內糖廠澄清應用效果最好的是聚丙烯酰胺(PAM)，但其潛在的使用安全性和二次污染問題卻越來越受到關注[1-3]。伴隨人們環保意識的增強和行業管理越來越規范化，特別在食品行業對絮凝劑的安全性和環保性提出了更高的要求，開發安全無毒、無二次污染的糖用生物絮凝劑對食糖的安全具有重要的現實意義。

迄今為止，已經報導的生物絮凝劑(MBF)產生菌就有超過60多種，但絮凝劑用量大，成本高等問題制約了生物絮凝劑在工業上廣泛應用[4]。因此，

尋找高效微生物絮凝劑產生菌，提高絮凝活性，降低絮凝劑用量，成為生物絮凝劑能否在工業上推廣的關鍵。微生物誘變育種能夠分離篩選優良的菌株，已被廣泛應用。常用的微生物育種方法，主要有物理誘變、化學誘變和兩者復合誘變[5]。作為物理誘變的一種，紫外誘變具有設備簡單、效率高、操作簡單等優點。本試驗以地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)為出發菌株，通過紫外誘變選育出一株產絮凝劑的高效菌株，搖瓶發酵制備生物絮凝劑應用于廣西農墾糖業集團金光制糖有限公司的甘蔗中和汁進行澄清試驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

絮凝劑產生菌地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，由廈門大學提供。

1.1.2 樣品

硫熏中和汁來自廣西農墾糖業集團金光制糖有限公司2014/15年榨季生產線取樣。

1.1.3 培養基

1.1.3.1 種子培養基(g/L)

葡萄糖10，酵母膏0.5，尿素0.5，KH2PO40.1，K2HPO40.1，NaCl 0.1，MgSO40.2，pH 7.2

1.1.3.2 平板培養基(g/L)

蔗糖10，酵母膏1，尿素1，NaCl 0.1, KH2PO40.1，K2HPO40.1，MgSO40.2，瓊脂15.0，pH 7.2

1.1.3.3 發酵培養基(g/L)

葡萄糖13.4，酵母膏0.6，尿素2.35，KH2PO45.6，K2HPO41.4，NaCl 2，MgSO40.055，pH 7.2

1.2 方法

1.2.1 培養方法

1.2.1.1 菌種活化

將出發菌轉接到新鮮斜面培養基內，37℃培養12 h。

1.2.1.2 種子培養

取一環活化后的菌株接入裝有50 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，于37℃、200 r/min下搖瓶培養16 h。

1.2.1.3 發酵培養

以2%的接種量(v/v)將種子液接入發酵培養基中，于37℃、200 r/min下搖床培養48 h。

1.2.2 紫外線誘變[6]

將地衣芽孢桿菌新鮮斜面用0.85%的生理鹽水將菌苔洗下，3000 r/min離心10 min，棄上清，用生理鹽水洗滌菌體2-3次，制成單細胞菌懸液，用顯微鏡直接計數法調整細胞濃度為108個/mL。取5 mL菌懸液于9 cm內有磁力攪拌子的無菌平皿中，置于磁力攪拌器上，于波長253.7 nm，功率 8 W的紫外燈下，距離20cm，照射60 s后開蓋振蕩照射。照射20、25、30、35、40、50、60 s分別取樣，放置于冰水中1～2 h，采用10倍稀釋法，選擇每個平板上長有50～200個菌落的稀釋度涂布平板培養基，每個稀釋度3個平行，于37℃進行暗培養24 h。并設立對照，最后進行活菌計數，計算致死率。致死率=﹙1-誘變后活菌數／誘變前活菌數﹚×100%。

1.2.3 突變株的篩選

挑選形態大，表面光滑，周邊粘稠的單菌落初篩，接至斜面培養基培養保存。在發酵培養基中，對初篩得到的單菌落復篩，37℃、200 r/min下搖床培養48 h后測定絮凝率，保存絮凝活性較高的菌種。

1.2.4 菌種穩定性考察

將復篩得到的菌株與出發菌株進行平行繼代遺傳穩定性實驗，轉接5代，再進行搖瓶發酵，測定發酵液的絮凝活性，觀察其遺傳穩定性。

1.2.5 絮凝率的測定

50 mL具塞比色管中加入40 mL 10 g/L高嶺土懸浮液，2.5 mL 10 g/LCaCl2溶液，1 mL發酵液，加蒸餾水至刻度，搖勻后靜置5 min，用分光光度計在550 nm處測定吸光度A，以空白發酵培養基的吸光度A0為對照確定培養液的絮凝活性，以絮凝率表示：絮凝率(%)=（A0-A）/A0×100%。

1.2.6 絮凝活性成分的穩定性

1.2.6.1 絮凝活性成分的熱穩定性

取發酵液于若干試管中（10 mL/管），分別在20、30、40、50、60、70、80、90、100℃溫度下水浴加熱30 min，按1.2.5節方法測定它們的絮凝活性。

1.2.6.2 絮凝活性成分pH穩定性

取發酵液于若干個試管中（每管10 mL），分別在pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11下，4℃放置24 h后按照1.2.5節方法測定它們的絮凝活性。

1.2.7 絮凝實驗

取生產流程上的硫熏中和汁（硫熏強度20 cc，pH 7.0～7.2），加熱煮沸，加MBF或PAM（絮凝劑

用量按實驗定量），攪拌均勻，迅速倒入500 mL的量筒中沉降，計時并記錄沉降速度，取清汁分析。

2 結果與分析

2.1 誘變時間的選擇

紫外線照射時間對菌株致死率的影響見圖1。在照射20 s時，其致死率己達到66.4%，由此可見出發菌株對紫外線較敏感。根據致死率為90%左右的誘變效果最好[7]，選取誘變時間為25 s。

圖1 紫外誘變菌株致死率曲線

2.2 菌種篩選

出發菌株（絮凝率65.0%）經過紫外線照射誘變后，篩選得到絮凝活性較高的正突變菌株，經過反復篩選，獲得1株絮凝率達76.0%的正突變菌株。

由于誘變菌株的性狀常常不穩定，尤其是在連續傳代培養時，為了檢測菌株性狀是否穩定，將誘變出的菌株在斜面繼代培養5代，分別檢測每代的絮凝率，最后得到1株絮凝性能穩定的菌株，每代的絮凝率分別為76.0、74.3、75.2、73.8、74.9、73.1%，5代絮凝率沒有顯著性差異。說明傳代次數對絮凝率影響不顯著，誘變菌株遺傳性能穩定。

2.3 絮凝劑的熱穩定性

為了考察該絮凝劑的熱敏性，將發酵液分別在不同的溫度下水浴加熱30 min后，測定其絮凝活性變化情況，由絮凝活性的變化趨勢來確定該絮凝劑對溫度的敏感程度，結果如圖2所示。由圖2可知，高溫加熱對絮凝劑的活性影響不大。

2.4 絮凝劑的pH穩定性

將發酵液的pH調至不同的值，于4℃冰箱放置24 h后，測定其絮凝活。結果如圖3所示。由圖3可知，絮凝劑定pH為3～11范圍內保持了良好的絮凝穩定穩。

圖2 生物絮凝劑的熱穩定性

圖3 生物絮凝劑的pH穩定性

2.5 最適生物絮凝劑添加量確定

取約3500 mL硫熏中和汁，加熱煮沸后分別量取500 mL各加入2 ppm PAM（0.067%濃度1.5mL）、5、10、15、20 U/mL MBF，以不加任何絮凝劑的中和汁為空白，攪拌均勻后迅速倒入500 mL量筒中。觀察并記錄沉降速度，靜置30 min后分別取上清汁分析錘度、pH值、色值、純度，結果見表1。

表1 最適生物絮凝劑添加量

由表1可知，中和汁加熱至100℃，無論是否加絮凝劑都能沉降，絮凝劑加入量不同沉降速度也不同。其中不加絮凝劑的空白組沉降速度最慢，且肉眼能觀測到清汁有微粒懸浮；加絮凝劑組的泥汁顆粒較大，沉降速度較快。加2 mg/kg PAM組沉降速度最快，加MBF組的沉降速度以10 U/mL組的沉降速度接近加2 mg/kg PAM組沉降速度，多于10 U/mL組的沉降速度反而下降，因此選擇10 U/mL MBF替代PAM進行下一步試驗。

2.6 PAM、MBF及復合絮凝劑的澄清工藝比較

取約3500 mL硫熏中和汁，加熱煮沸后分別量取500 mL各加入2 mg/kg PAM、10 U/mL MBF、5 U/mL MBF+1 ppm PAM攪拌均勻后迅速倒入500 mL量筒中。觀察并記錄沉降速度，靜置30 min后取上清汁分析錘度、pH值、色值、純度。傾出清汁留125 mL泥汁進行泥汁過濾效果評價，數據見表2。結果表明復合絮凝劑組的沉降速度優于MBF組，更接近PAM組。對清汁質量指標及泥汁過濾效果進行比較，從清汁質量指標看，各組的沉降清汁pH、錘度、色值、純度均沒有很大的差異。從泥汁過濾速度來看，PAM組的過濾速度明顯快些，應該與泥汁顆粒大小有關，這個因素有待進一步實驗探討。

表2 PAM、MBF及復合絮凝劑對中和汁的絮凝效果

3 結論

本研究用紫外線誘變處理地衣芽孢桿菌，經初篩、復篩最終得到1株產絮凝劑的高效菌株，其絮凝活性較出發菌株提高17%。穩定性試驗結果表明該菌株具有良好的熱穩定性及廣泛的pH穩定性。

蔗汁澄清是制糖工業生產的關鍵環節，絮凝劑在其中起著至關重要的作用。就當前而言，仍未有一種十分滿意的糖用絮凝劑。通過上述試驗可以看到，生物絮凝劑具有取代聚丙烯酰胺的潛力，可以應用在蔗汁澄清工藝；生物絮凝劑與聚丙烯酰胺協同使用，蔗汁的沉降速度與單獨使用聚丙烯酰胺接近，且清汁各項質量指標均沒有明顯差異。將具有安全無二次污染等優點的生物絮凝劑應用于制糖工業，部分或完全取代有毒性殘留隱患的聚丙烯酰胺在技術上是可行的。糖用生物絮凝劑的開發，將會對我國制糖工業提高經濟效益、提高產品質量起到良好的促進作用。

[1] 李善斌，孫衛東. 糖用絮凝劑在制糖過程中的應用進展[J]. 廣西輕工業，2010，26(2)：6-7，48.

[2] 鐘志才，徐杰榮，黃俊生，等. 糖廠常用絮凝劑的應用研究和新型絮凝劑的展望[J]. 廣西糖業，2014(6)：34-40.

[3] CHAI S L, JOHN R, MEI F C. A review on application of flocculants in wastewater treatment[J]. Process Safety and Environmental Protection, 2014, 92(6): 489-508.

[4] 李雨虹，梁達奉，常國煒，等. 微生物絮凝劑研究進展[J].甘蔗糖業，2014(5)：51-56.

[5] 吳煥利，馮貴穎，趙淑艷，等. 紫外誘變選育高效微生物絮凝劑產生茵及其應用[J]. 西北農林科技大學學報：自然科學版，2008，36(8)：113- 118.

[6] 沈萍，陳向東. 微生物學實驗：4版[M]. 北京：高等教育出版社，2008：127.

[7] 施巧琴，吳松剛. 工業微生物育種學：3版[M]. 北京：科學出版社，2009：37-38．

(本篇責任編校：朱滌荃)

Preparation of Bioflocculant and Its Application in Clarification Process of Sugarcane Juice

LI Yu-hong1, ZENG Lian-qiang1, MA-Bu2, ZHONG Zhi-cai1, CHANG Guo-wei1, LI Zhi-de1, XU Yan-fang3,
LIANG Da-feng1,2
(1Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute/Guangdong Key Lab of Sugarcane Improvement & Biorefinery, Guangzhou 510136;2Guangxi Sugarcane Industry R & D Center, Nanning, Guangxi 53000;3Insitute of Light Industry and Food Engineering, Guangxi University, Nanning, Guangxi 530004)

A bioflocculant production mutant was screened from Bacillus licheniformis by ultraviolet (UV), and tested the flocculation in clarification of the neutral juice. The results showed that flocculation rate of mutant was increased by 17% compared with the original strain. The 10 U/mL bioflocculant had comparative effect in clarification of the neutral juice with 2 mg/kg polyacrylamide, indicating the possibility of bioflocculant application in sugar industry.

Ultraviolet mutagenesis; Bioflocculant; Neutra1 juice; Clarification

TS244+.2

A

1005-9695(2015)05-0033-05

2015-09-15；

2015-10-15

南寧市工信委技術創新項目（編號2014-1-30）；八桂學者建設工程專項經費資助

李雨虹(1981-)，女，工程師，主要從事食品生物技術研究工作

*通訊作者：梁達奉(1964-)，男，博士，教授級高級工程師，國家甘蔗產業技術體系崗位科學家，主要研究方向：制糖生物技術；

E-mail:ldfjt@126.com

李雨虹，曾練強，馬步，等. 生物絮凝劑的制備及其在蔗汁澄清的應用探索[J]. 甘蔗糖業，2015(5)：33-37.