有機磷農藥敵敵畏中毒對大鼠胰腺損害的實驗研究

張慶龍，程景林，周 姝

(安徽醫科大學第二附屬醫院急診內科，安徽合肥 230601)

有機磷農藥(OPs)被廣泛用于農業生產中，據估計，全世界每年因 OPs造成的中毒事件超過3 000 000起，其中 220 000 人死亡［1］，我國每年約5～7萬人發生急性有機磷農藥中毒，其病死率高達10%［2］。因此對有機磷農藥中毒機制的進一步探討具有重要的臨床意義。國內外有研究報道，急性有機磷農藥中毒(AOPP)患者常合并胰腺損害［3－4］，我科在臨床實踐中也發現類似情況。目前關于AOPP致急性胰腺損害的報道多為回顧性分析，AOPP是否引起胰腺損害、中毒程度是否與胰腺損害存在正相關，無相關研究證據。本研究采用高毒性的敵敵畏經口服給藥制作大鼠AOPP模型，監測大鼠給藥后不同時間的血清膽堿酯酶、血清淀粉酶，觀察給藥24 h后胰腺病理改變，從而初步探討染毒大鼠胰腺損害發生情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗大鼠:安徽醫科大學動物實驗中心(省動物實驗中心)提供的清潔級雌性SD大鼠60只，月齡3個月，體重(250±20)g。合格證號:34000200000101。

實驗藥品:由山東大成農藥有限公司提供的濃度為80%的敵敵畏原液。

實驗試劑:由上海明豐生物科技有限公司提供的膽堿酯酶及淀粉酶的ELISA試劑盒。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物準備 實驗大鼠常規喂飼，實驗前12 h動物禁食但不禁飲，可自由活動。

1.2.2 實驗分組 將雌性SD大鼠隨機分為3組:玉米油對照組，敵敵畏低劑量實驗組，敵敵畏高劑量實驗組，每組各20只。

1.2.3 灌喂方法 對照組:分別灌喂玉米油2 mL。敵敵畏低劑量組:分別灌喂80%敵敵畏原液與玉米油按一定比例配制成的乳油2 mL，灌喂的農藥劑量為8 mg·kg－1體重;敵敵畏高劑量組:分別灌喂80%敵敵畏原液與玉米油按一定比例配制成的乳油2 mL，灌喂的農藥劑量為20 mg·kg－1體重。

1.2.4 指標檢測 灌喂后6、24 h分別取大鼠內眥動脈血，以ELISA法測定血清膽堿酯酶、血清淀粉酶。

1.2.5 切片操作 給藥24 h后斷頭處死大鼠，迅速剖腹摘取胰腺頭部組織，放入10%甲醛中固定24 h，后石蠟固定，切片，HE染色。

1.2.6 胰腺組織病理學評分 在光鏡下閱片，每張切片隨機選擇5個高倍視野(×200)，觀察胰腺組織病理學的變化，按照Schmidt等［5］標準從水腫、出血、壞死及炎癥細胞浸潤4個方面評分。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0軟件包進行數據分析。觀測資料均為計量資料，采用均數±標準差±s)表示，均通過正態性檢驗。3組間的整體分析為單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清膽堿酯酶、淀粉酶變化

2.1.1 血清膽堿酯酶的比較 數據列于表1。染毒后各時點血清膽堿酯酶水平，3組間整體分析(單因素方差分析)，差異均顯著(P＜0.05)。再于各時相點處做3組間兩兩比較(LSD檢驗)，并結合數據來看:與對照組同時相點比較，低劑量組、高劑量組血清膽堿酯酶水平明顯降低，組間差異有統計學意義(P＜0.05);與低劑量組同時相點比較，高劑量組膽堿酯酶下降更明顯，差異有統計學意義(P＜0.05)。詳見表1。

表1 大鼠血清膽堿酯酶的比較(U·L－1，±s)

表1 大鼠血清膽堿酯酶的比較(U·L－1，±s)

組別 n 染毒后6 h 染毒后24 h A1:對照組20 866±178 692±184 A2:低劑量組 20 568±135 468±134 A3:高劑量組 20 465±110 304±118整體分析 F，P 41.796，0.000 34.758，0.000 A2 vs A1 LSD-t，P 6.547，0.000 4.799，0.000 A3 vs A1 LSD-t，P 8.800，0.000 8.304，0.000 A3 vs A2 LSD-t，P 2.254，0.028 3.505，0.001

2.1.2 血清淀粉酶的比較 數據列于表2。其變化規律如同前述膽堿酯酶:染毒后各時點血清淀粉水平，3組間單因素方差分析，差異均顯著(P＜0.05)。再于各時點處做3組間兩兩比較，并結合數據來看:與對照組同時相點比較，低劑量組、高劑量組血清淀粉酶水平明顯降低，組間差異有統計學意義(P＜0.05);與低劑量組同時相點比較，高劑量組血清淀粉酶下降更明顯，差異有統計學意義，P＜0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠血清淀粉酶的比較(U·L-1，±s)

表2 各組大鼠血清淀粉酶的比較(U·L-1，±s)

組別 n 染毒后6 h 染毒后12 h A1:對照組20 1 718±125 1 739±291 A2:低劑量組 20 1 971±157 2 248±341 A3:高劑量組 20 2 268±160 2 555±376整體分析 F，P 68.502，0.000 29.781，0.000 A2 vs A1 LSD-t，P 5.392，0.000 4.779，0.000 A3 vs A1 LSD-t，P 11.693，0.000 7.638，0.000 A3 vs A2 LSD-t，P 6.301，0.000 2.858，0.006

2.2 胰腺病理學觀察及評分

2.2.1 各胰腺組織HE切片的病理學觀察 對照組:大鼠胰腺組織結構清晰，腺泡小葉完整，胰腺組織小葉間無水腫，無血細胞聚集，腺泡細胞無水腫及壞死，血管未見充血、出血，未見炎性細胞滲出(圖1);低劑量組:胰腺間質內充斥少量淡紅色水腫液，部分腺泡呈孤島狀，胰腺實質及間質內見少量炎癥細胞浸潤，血管擴張、充血、出血，可見灶性炎性滲出(圖2);高劑量組:鏡下表現與低劑量組大體相似，與低劑量組相比病變程度加重，部分切片邊緣組織細胞充血明顯(圖3)。

2.2.2 大鼠胰腺組織Schmidt J病理學評分 數據列于表3。整體分析知:大鼠胰腺組織Schmidt J病理學評分，三組間整體差異顯著(P＜0.05)。兩兩比較也均有統計學意義(P＜0.05)。結合數據來看:與對照組比較，低劑量組、高劑量組大鼠胰腺Schmidt J病理學評分明顯升高;與低劑量組比較，高劑量組評分更高。

表3 三組大鼠造模后病理組織學評分(±s)

表3 三組大鼠造模后病理組織學評分(±s)

組別 n Schmidt J 病理學評分A1:對照組20 2.74 ±1.12 A2:低劑量組 20 4.25 ±0.84 A3:高劑量組 20 6.33 ±2.92整體分析 F，P 23.225，0.000 A2 vs A1 LSD-t，P 2.488，0.016 A3 vs A1 LSD-t，P 6.739，0.000 A3 vs A2 LSD-t，P 4.251，0.000

3 討論

OPs多屬有機磷酸酯類化合物，具有大蒜樣臭味。一般不溶于水，可溶于有機溶劑。有學者提出了有機磷農藥中毒的可能機制，如有機磷農藥刺激接觸人體組織器官，被人體吸收后形成一種泛組織毒素，從而造成機體的多種組織器官損傷，如肝臟、腎臟、心臟、胰腺等，特別是神經系統。OPs引起中毒的作用機制主要是抑制膽堿酯酶活性，使膽堿酯酶喪失分解乙酰膽堿的能力，導致膽堿能突觸內乙酰膽堿蓄積，從而過度刺激毒蕈堿和煙堿樣受體。這一“膽堿能綜合征”表現為:出汗、流涎、支氣管分泌物增多、支氣管狹窄、瞳孔縮小、胃腸蠕動增強、腹瀉、肌肉震顫和多種中樞神經系統效應。有機磷農藥引起的死亡被認為主要是由于抑制了位于腦干的呼吸中樞、引起支氣管狹窄和支氣管分泌物增多、呼吸肌的弛緩性麻痹［6］。

急性胰腺炎發病危急，疾病癥狀重，嚴重并發癥多，患者病死率高［7］。其發病機制迄今尚未完全闡明，以前的傳統觀點主要認為是以胰酶的自身消化為主，而近年來人們逐漸提出許多新的學說。有大量實驗證實，胰腺微循環障礙與急性胰腺炎發生有關，并影響到疾病發展。病理過程表現為:胰腺小葉內動脈痙攣、栓塞，造成支配區域缺血壞死，以缺血為特征的胰腺微循環障礙，另外多種炎癥介質，如腫瘤壞死因子、緩激肽、血小板激活因子、內皮素等作用于小葉動脈，也能引起微循環障礙。以上過程可進一步發展進入胰腺炎的共同發生機制通路，最終激活多種蛋白酶，引起胰腺及其周圍組織自身消化，釋放多種炎癥因子，引起全身炎癥反應。而通過我們長期的臨床觀察及回顧國內外眾多的臨床報道發現，有機磷農藥中毒后能啟動這一病理過程。OPs中毒患者血、尿淀粉酶大多出現不同程度的升高，部分患者甚至發生出血、壞死性胰腺炎，最終死于多器官功能衰竭。根據國內外許多回顧性臨床研究報道結論，我們推測AOPP患者胰腺損傷致血、尿淀粉酶增高的機制可能為:(1)患者在中毒時，大量膽堿酯酶堆積，毒蕈堿樣癥狀引起胰腺等腺體分泌亢進，迷走神經處于興奮狀態，導致血液中淀粉酶的活性增高［8］;(2)OPs大多偏酸性，直接刺激胃黏膜產生大量胃泌素，使胰酶分泌增加，從而血清淀粉酶升高;(3)中毒后oddis括約肌處于痙攣狀態，造成胰管梗阻，導致胰腺腺泡及胰小管破裂，胰酶溢出，引起胰腺組織出血、壞死，發生胰腺炎［9］;(4)副交感神經末梢的興奮導致毒蕈堿樣癥狀出現，致使平滑肌和腺體活動增加，唾液腺分泌增強，也促使血清淀粉酶升高［10］;(5)可能由于應激、高代謝狀態造成胰腺組織局部血液循環障礙，導致胰腺缺血缺氧所致［11－12］。

血、尿淀粉酶是反映胰腺腺泡細胞損害的重要指標。絕大多數胰腺炎患者在發病早期(2～12 h內)即可出現血淀粉酶升高，3～5 d后恢復正常;尿淀粉酶在血淀粉酶升高2 h后即可升高，且持續時間更長。然而，對于動物胰腺炎的診斷，國內外現并無統一標準，且多為個案報道為主，相關報道主要通過觀察大鼠血清淀粉酶變化，判定是否有胰腺炎，但并無淀粉酶升高的程度及胰腺炎診斷的關聯直接依據。張秀文等［13］等報道，Ams升高率與中毒患者病情輕重有密切關系，病情越重，Ams升高越明顯，我們揣測，動物可能也有相似關系。黃冬等［14］的動物模型實驗也有相似報道，因此，本實驗我們通過監測大鼠淀粉酶的變化以及結合大鼠胰腺組織的病理學變化，明確大鼠是否出現胰腺損傷以及損傷的程度。

本文通過大鼠實驗，研究發現，同一時點，從對照組、敵敵畏低劑量組到敵敵畏高劑量組，血清膽堿酯酶水平逐漸下降，提示隨著給藥濃度的增大，大鼠中毒程度逐漸加重。相應時點，3組大鼠血清淀粉酶水平逐漸升高，提示大鼠胰腺損傷逐漸加重。因此，我們推測有機磷農藥敵敵畏中毒與大鼠急性胰腺損害存在因果關系，且隨著中毒程度加重胰腺損害更明顯。另一方面，通過大鼠胰腺組織病理學結果也印證了這一觀點。光鏡下觀察發現，對照組大鼠胰腺結構清晰，腺泡小葉完整，胰腺組織小葉間無水腫，無血細胞聚集，腺泡細胞無水腫及壞死，血管未見充血、出血，未見炎性細胞滲出，胰腺組織Schmidt J病理學評分(2.74±1.12)分。低劑量組大鼠胰腺實質及間質內見少量炎癥細胞浸潤，血管擴張、充血、出血明顯，并可見可見灶性炎性滲出，病理學評分(4.25±0.84)分，較對照組升高明顯。敵敵畏高劑量組光鏡下觀察胰腺組織病變程度更重，胰腺組織評分進一步升高至(6.33±2.92)分。據我們所知，這是目前第一個探討有機磷農藥中毒與胰腺損害實驗的研究。而根據我科長期臨床實踐發現，急性胰腺損傷與有機磷中毒患者病情的嚴重程度密切相關，這與有關文獻報道相符［15－16］。因此，在臨床上對AOPP患者應重視急性胰腺炎的診斷和救治。因此，在臨床上對AOPP患者應重視急性胰腺炎的診斷和救治。

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