HPLC法同時測定大鼠血漿中CYP450酶探針藥物氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪達唑侖濃度

朱冬春，程 鋼，孫旭群，蘇 涌，吳 娟，夏 泉，許杜娟

(1.安徽醫(yī)科大學藥學院，安徽合肥 230032;2.安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥劑科，安徽合肥 230022)

大多數(shù)藥物進入機體后，在細胞色素 P450(CYP450)酶催化下發(fā)生代謝解毒或者代謝活化，這些需要CYP450酶代謝的藥物同時使用，通過影響CYP450酶活性，有可能產(chǎn)生相互干擾［1］，發(fā)生藥物間相互作用，影響療效導致用藥不良反應［2］。探針藥物法即通過考察特異性探針藥物的代謝變化，反映相應 CYP450酶的活性，進而評價藥物對CYP450酶的影響［3］，對預測可能的藥物相互作用有重要價值［4］。CYP450酶由多種亞型組成，傳統(tǒng)的單探針藥物法，采用一種探針藥物，每次反映一個或一組代謝酶的活性，效率較低，很難滿足現(xiàn)代研究快速、方便以及經(jīng)濟性的要求;“Cocktail”探針藥物法是通過考察多個特異性探針藥物的代謝，同時評價多種代謝酶亞型的活性變化，具有快速、經(jīng)濟等特點，成為研究藥物相互作用的重要途徑［5－9］。CYP2E1、CYP2C9和 CYP3A4是 CYP450酶系中3種重要的亞型，占肝臟CYP450酶總量的一半以上，其活性與多種藥物的療效甚至某些疾病的發(fā)生密切相關(guān)［10－12］，其中氯唑沙宗是廣泛認可的 CYP2E1探針藥物，甲苯磺丁脲在體內(nèi)幾乎由CYP2C9介導的單一途徑代謝，咪達唑侖也是評價CYP3A4代謝活性最為常用的探針藥物，此3種探針藥物給藥后體內(nèi)的血藥濃度變化特征，可分別反映CYP2E1、CYP2C9和CYP3A4此3種代謝酶亞型的活性［13－14］。但氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪達唑侖的血藥濃度同時測定，文獻報道多使用質(zhì)譜方法，操作復雜，成本較高［15－18］，本實驗嘗試建立快速、方便的高效液相色譜法，同時測定3種探針藥物氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪達唑侖血漿濃度，為考察3種探針藥物在體內(nèi)的藥代動力學變化，以及進一步研究藥物相互作用提供參考。

1 實驗材料

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀(包括自動進樣系統(tǒng)、四元梯度洗脫泵、在線脫氣機、柱溫箱、DAD檢測器和色譜工作站，美國Agilent公司);XW－80A旋渦混合器(上海醫(yī)科大學儀器廠);HYC－362A藥品保存箱(海爾集團);DW－FL270超低溫冷藏箱(中科美菱);TGL－185臺式高速冷凍離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司);METYLER XP－205電子天平(上海Mettler－Toledo有限公司);FA2004上皿電子天平(上海精科天平);MG－2200型氮吹儀(日本Tokyo RIKAKIKAI)。

1.2 試藥 地西泮(批號:1159302)、咪達唑侖(批號:171265－201001)、氯唑沙宗(批號:100364－201302)標準品均購自中國藥品生物制品檢定所，甲苯磺丁脲(批號:C17589900)德國Dr.Ehrenstorfer公司;甲醇為色譜純(Tedia Company，美國)，滅菌注射用水購于四川科倫藥業(yè)，其余試劑為分析純。

1.3 動物 健康雄性清潔級 SD大鼠，體重200～240 g，安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。飼養(yǎng)溫度20～25℃，濕度50% ～60%。給予普通飼料，自由飲水，適應性喂養(yǎng)1周后禁食12 h，眶靜脈取血，5 000 r·min－1離心，取上清液制得空白血漿。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Dikma Diamonsil C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動相:甲醇與 pH3.45磷酸二氫銨(0.05 mol·L－1)按 61∶39(V/V)比例配制，流速:1 mL·min－1，進樣量40 μL，柱溫35℃，波長230 nm，帶寬4 nm。

2.2 對照品溶液和內(nèi)標溶液的制備 精密稱取氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、咪達唑侖以及內(nèi)標地西泮標準品各25 mg，分別置于25 mL的量瓶中，加甲醇制成1 g·L－1對照品儲備溶液。取1 g·L－1的地西泮溶液1 mL，加入50 mL容量瓶中甲醇定容，得到20 mg·L－1的內(nèi)標工作溶液;各取配制好的1 g·L－1氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、咪達唑侖對照品溶液2.5 mL，加入25 mL容量瓶中甲醇定容，即得100 mg·L－1的混合探針甲醇儲備溶液。

2.3 血漿樣品的制備與處理 取對照品的甲醇溶液，氮氣吹干，加入大鼠血漿100μL，渦旋震蕩2 min，即制備成相應濃度的血漿樣品。在血漿樣品100μL中加入內(nèi)標溶液10μL(地西泮20 mg·L－1)，渦旋渦旋震蕩 2 min，加入三氯甲烷 1.6 mL，渦旋 3 min，12 000 r·min－1離心10 min，吸除上層，取下層有機相1.2 mL于另一試管中，氮氣吹干，100μL流動相渦旋3 min復溶，進樣40μL。

2.4 方法學考察

2.4.1 系統(tǒng)適用性 制備含氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪達唑侖各2 mg·L－1的對照品混合溶液，氮氣吹干后加100μL流動相渦旋3 min復溶，按“2.1”項下方法進樣測定，考察標準品色譜圖。取含氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪達唑侖各2 mg·L－1的對照品混合溶液，按“2.3”項下方法血漿處理操作，制備并處理含3種探針藥物各2 mg·L－1的血漿樣本，按“2.1”項下方法進樣測定，考察血漿樣品色譜圖。另取空白血漿，不加內(nèi)標，按“2.3”項下血漿處理方法操作，考察空白血漿色譜圖。

結(jié)果氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、咪達唑侖以及內(nèi)標地西泮保留時間穩(wěn)定，藥物色譜峰與相鄰雜質(zhì)色譜峰分離良好，色譜結(jié)果詳見圖1。

2.4.2 標準曲線的制備 制取不同濃度的3種探針藥物混合甲醇溶液100μL，氮氣吹干后加入空白血漿100μL，制備成氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪達唑侖濃度為 0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 mg·L－1的系列血漿樣品，按“2.3”項下方法進行血漿處理操作，HPLC進樣測定，測峰面積，以對照品濃度(C)為縱坐標，對照品峰面積與內(nèi)標峰面積比為橫坐標(A)，繪制標準曲線并進行線性回歸。結(jié)果氯唑沙宗標準曲線方程為 C=6.404A+0.033，r=0.999 5，甲苯磺丁脲標準曲線方程為C=8.762A－0.063，r=0.999 5;咪達唑侖標準曲線方程為 C=2.215A+0.023，r=0.999 5。氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪達唑侖均在0.1～50 mg·L－1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。見圖2。

2.4.3 定量下限 取含氯唑沙宗、甲苯磺丁脲與咪達唑侖0.1 mg·L－1的3種探針藥物對照品溶液100μL，氮氣吹干后加入空白血漿100μL。平行制備3份，按“2.3”項下方法血漿處理，后將3份所得樣品混勻，按“2.1”項下色譜條件平行進樣分析5次，氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪達唑侖實測濃度分別為(0.118 ±0.011)、(0.113 ±0.011)和(0.116±0.006)mg·L－1。3種成分準確度均在真實濃度的80%～120%之間，且相對標準偏差(RSD)小于20%，因此 0.1 mg·L－1氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪達唑侖的對照品溶液，符合生物樣品的定量分析要求。

2.4.4 精密度試驗 取對照品混合溶液制備低、中、高3 種不同濃度(0.4、2、20 mg·L－1)的氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪達唑侖血漿樣品，按“2.3”項下方法樣品處理，再按“2.1”項下方法色譜測定。一日內(nèi)測定5次，在連續(xù)的5 d內(nèi)分別進行平行試驗一次，測定各成分在的色譜峰面積與內(nèi)標峰面積，分別按“2.4.2”項下各標準曲線計算實測濃度，利用Excel軟件求算RSD，結(jié)果在低、中、高濃度下，氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪達唑侖精密度 RSD為4.78% ～9.78%，符合生物樣本測定要求。具體結(jié)果見表1。

2.4.5 回收率試驗 各取對照品制成低、中、高不同濃度的氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪達唑侖(0.4、2、20 mg·L－1)的血漿樣本，每個濃度5個平行樣本，按“2.3”項下方法樣品處理，再按“2.1”項下方法色譜測定。按標準曲線計算氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪達唑侖濃度，實測值與加入值的比值計算回收率。結(jié)果3種探針藥物的總回收率在92.71% ～109.79%范圍內(nèi)，符合生物樣本測定要求。結(jié)果見表1。

表1 大鼠血漿中3種探針藥物HPLC法測定的精密度與回收率(n=10)

2.5 穩(wěn)定性試驗 考察3種探針藥物在保存條件下的穩(wěn)定性，氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪達唑侖的血漿樣品在－20℃中冷凍保存，在10、30 d測定樣品中藥物濃度，結(jié)果樣品濃度無明顯變化;對照品的甲醇溶液在2～8℃避光冷藏，考察其濃度變化，結(jié)果該條件下樣品溶液6個月濃度無變化。血漿樣品在室溫(25±3)℃下放置以及處理后放置24h內(nèi)穩(wěn)定。測定結(jié)果表明，各樣品在相應保存條件下穩(wěn)定性良好。

3 討論

血漿藥物濃度常用檢測方法有氣相色譜法、液相色譜法、色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法等，其中高效液相色譜法操作相對簡單，成本較低，使用更為廣泛。本研究選用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)聯(lián)用紫外檢測器，探索血漿樣本藥物濃度的分析方法。對3種探針藥物進行全波長掃描，各探針藥物在230 nm均有較大紫外吸收。參考藥典以及文獻中氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪達唑侖的分析方法［19－20］，并結(jié)合其化學結(jié)構(gòu)，理化性質(zhì)等特點，最終選用甲醇和 0.05 mol·L－1的磷酸二氫銨(pH3.45)溶液作為3種探針藥物的色譜流動相，其比例在61∶39時各探針藥物、內(nèi)標與雜質(zhì)分離良好。

合適的血漿樣品前處理對建立準確、可靠的HPLC方法至關(guān)重要［21］。常見如有機溶劑沉淀法、液液萃取法和固相萃取法等處理方法。相對于蛋白沉淀法、液液萃取法制備樣品內(nèi)源性雜質(zhì)少，能更好消除基質(zhì)效應的影響，且易濃縮處理，適用于低濃度的生物樣品分析［22］。本實驗采用16倍體積氯仿作為萃取溶劑，氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪達唑侖取得的提取回收率和重現(xiàn)性均符合要求。

本方法操作簡便，靈敏度高，快速可靠，適用于同時測定3種CYP450酶亞型探針藥物氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪達唑侖的大鼠血漿藥物濃度，可為評價大鼠體內(nèi)CYP2E1、CYP2C9和CYP3A4同工酶活性，以及為藥物相互作用研究提供分析方法學參考。

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