HPLC法測(cè)定炙甘草中主要化學(xué)成分含量的研究

劉亞萍，曹雨誕

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210046)

甘草為豆科植物(Leguminosae)甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)的干燥根和根莖，味甘、偏涼，具有瀉火解毒、化痰止咳的功效。甘草蜜制后可以益氣補(bǔ)中［1］，主要用于心氣不足而導(dǎo)致的脈結(jié)代、心動(dòng)悸等癥狀［2］。炙甘草含有甘草中的主要成分，其中的主要化學(xué)成分有黃酮類、三萜類、香豆素類和多糖類等成分［3］。甘草經(jīng)蜜制后，所含化學(xué)成分的含量與甘草相比有所變化，如甘草苷和甘草酸含量下降［4］，同時(shí)產(chǎn)生糠醛衍生物等化學(xué)成分［5］。與甘草相比，炙甘草的補(bǔ)益作用更強(qiáng)［6］。近年來(lái)對(duì)炙甘草的含量測(cè)定有一些報(bào)道，指紋圖譜研究也有一定進(jìn)展［6－7］，為進(jìn)一步研究炙甘草的化學(xué)成分，為炙甘草藥效研究提供依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)炙甘草中的4種主要成分甘草苷、甘草素、甘草酸和甘草次酸進(jìn)行了含量測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 HPLC分析采用Waters2695高效液相色譜儀，Waters2489 UV檢測(cè)器，Empower色譜工作站;Shimadzu AY220電子分析天平。

1.2 試劑 甲醇為色譜純(批號(hào):20140126)，購(gòu)自江蘇漢邦科技有限公司，水為自制重蒸水，其余試劑為分析純。

1.3 材料 炙甘草飲片樣品1(批號(hào)20121126)，購(gòu)自安徽豐源銅陵中藥飲品有限公司;樣品2(批號(hào)20130608)，購(gòu)自江蘇省中醫(yī)藥;樣品 3(批號(hào)20130711)，購(gòu)自南京同仁堂漢中路藥店，所購(gòu)飲片經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室吳德康教授鑒定為豆科甘草屬植物烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)的蜜制炮制品。

甘草苷(批號(hào)111610－201106)和甘草酸(批號(hào)101050－201101)對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，甘草素購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司(批號(hào)MUST－13012506)，甘草次酸購(gòu)自江蘇省藥品鑒定所(批號(hào)20130312)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil-C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);進(jìn)樣量:10 μL;流速:1.0 mL·min－1;其它色譜條件設(shè)定為柱溫:30℃;檢測(cè)波長(zhǎng):230 nm。流動(dòng)相為磷酸—乙腈系統(tǒng)，其中A為0.1%磷酸水溶液，B為乙腈，洗脫梯度洗脫設(shè)定為0～8 min，19% ～19%B;8 ～35 min，19% ～50%B;35 ～50 min，50% ～85%B;50 ～55 min，85% ～100%B;55～57 min，100% ～19%B，色譜圖見圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 各對(duì)照品經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h，精密稱取甘草苷2.90 mg、甘草素2.30 mg、甘草酸 2.50 mg，甘草次酸 2.04 mg，分別置于5 mL容量瓶中。樣品以甲醇溶解并稀釋至刻度，制備成4種對(duì)照品貯備溶液。精密吸取上述對(duì)照品貯備液各2.5 mL于10 mL容量瓶中，以甲醇定容，搖勻后即得炙甘草中4種混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 炙甘草飲片粉碎，過(guò)四號(hào)篩，稱取約0.5 g，精密稱定。粉末置于三角錐形瓶中，以70%乙醇50 mL超聲提取30 min，趁熱抽濾后減壓回收溶劑。殘?jiān)约状既芙猓糜?5 mL量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取1 mL至5 mL容量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4 線性關(guān)系與線性范圍 分別吸取上述混合對(duì)照品溶液 2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 μL，在上述“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣并測(cè)定。4種對(duì)照品以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸計(jì)算。所得回歸方程為甘草苷:Y=60 634X－19 319，r=0.999 2，在 0.73 ～5.08 μg呈良好的線性關(guān)系;甘草素:Y=34 464X－9 969，r=0.999 3，在0.58～4.53μg呈良好的線性關(guān)系;甘草酸:Y=33 602X－5 669，r=0.998 4，在 0.61 ～4.29 μg 呈良好的線性關(guān)系;甘草次酸:Y=27 696X－4 739，r=0.998 1，在0.51 ～3.57 μg呈良好的線性關(guān)系。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果顯示:在此條件下供試品溶液色譜中甘草苷、甘草素、甘草酸和甘草次酸的保留時(shí)間分別為11.337、22.960、31.744、51.179 min，與其他的成分有較好的分離效果，理論塔板數(shù)均在6 000以上，結(jié)果見圖1。

2.6 精密度試驗(yàn) 吸取混合對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測(cè)定并分別計(jì)算4個(gè)成分的峰面積，結(jié)果混合對(duì)照品中甘草苷、甘草素、甘草酸和甘草次酸的 RSD 分別為 1.75%、2.18%，1.60%和 1.60%。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品(炙甘草飲片樣品1)溶液6份，按照“2.3”項(xiàng)下的方法操作，結(jié)果甘草苷的平均含量為1.32%，RSD為2.52%;甘草素的平均含量為0.27%，RSD為2.60%;甘草酸的平均含量為4.87%，RSD為2.77%;甘草次酸的平均含量為0.16%，RSD為2.14%。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品(炙甘草飲片樣品1)，照“2.3”項(xiàng)下的方法操作。室溫條件下，分別在0、2、4、8、12 h 進(jìn)樣 10 μL，結(jié)果炙甘草中甘草苷、甘草素、甘草酸和甘草次酸在12 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD分別為 2.15%、2.60%、2.77%和 2.14%。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密量取上述6份已知含量(炙甘草飲片樣品1，其中甘草苷含量為1.32%，甘草素含量為 0.27%，甘草酸含量為4.87%，甘草次酸含量為0.16%)的供試品溶液2.5 mL至5 mL容量瓶中，精密加入甘草苷、甘草素、甘草酸和甘草次酸 3.57、1.92、14.09、0.84 mg，加甲醇定容至刻度，按上述色譜條件分別進(jìn)樣并計(jì)算，結(jié)果甘草苷、甘草素、甘草酸和甘草次酸的平均回收率分別為 99.0%、96.6%、103.0% 和 104.9%，RSD 分別為 0.6%、0.4%、0.3%和 1.4%。

2.10 樣品含量測(cè)定 取各炙甘草樣品，分別按照“2.3”項(xiàng)下所述方法制備成供試品溶液。各樣品分別進(jìn)樣10μL，進(jìn)行測(cè)定并以外標(biāo)法計(jì)算各成分含量，結(jié)果見表1。

表1 不同炙甘草飲片的含量測(cè)定(n=3)

3 討論

炙甘草中主要化合物有甘草酸、甘草次酸等三萜類、甘草苷、甘草素等二氫黃酮類以及異甘草素等查爾酮類成分。研究表明甘草素為甘草中的主要活性成分之一，具有抗癌［8］、預(yù)防糖尿病的應(yīng)激反應(yīng)［9］等活性，甘草素的提取分離及分析方法也日益受到關(guān)注［10］。炙甘草同時(shí)測(cè)定以上4種成分的文獻(xiàn)較少，所以我們選擇甘草素作為炙甘草的測(cè)定成分。炙甘草樣品提取經(jīng)70%甲醇、70%乙醇及甲醇3種溶劑的考察，確定其提取工藝為70%乙醇提取30 min。由于甘草酸和甘草次酸結(jié)構(gòu)中都有羧基，所以在流動(dòng)相中加入0.1%的磷酸，使得各組分均達(dá)到基線分離，獲得較好的分離效果。綜合考慮各組分的紫外最大吸收且經(jīng)過(guò)紫外掃描確定測(cè)定波長(zhǎng)為230 nm。本實(shí)驗(yàn)在同一色譜條件下同時(shí)測(cè)定了炙甘草中4種主要成分，所測(cè)樣品中甘草酸和甘草苷都符合《中國(guó)藥典》的規(guī)定，不同樣品中含量的差異可能與產(chǎn)地和加工方法有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)所用測(cè)定方法快捷準(zhǔn)確，可為炙甘草質(zhì)量控制及為今后炙甘草飲片的炮制和藥效學(xué)研究提供依據(jù)。

［1］齊方洲，朱慧芳，徐遼寅，等.炙甘草湯新論［J］.吉林中醫(yī)藥，2009，29(9):811－812.

［2］王 龍，王化良.炙甘草抗心律失常臨床應(yīng)用研究［J］.吉林中醫(yī)藥，2012，32(10):1074－1075.

［3］孫良明，楊永安.脹果甘草化學(xué)成分的分離與鑒定［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17(7):1121－1123.

［4］耿家玲，康紹建，柴文英.甘草、炙甘草飲片中甘草苷和甘草酸含量考察［J］.中國(guó)藥師，2011，14(12):1751－1753.

［5］周 倩，孫立立.蜜炙對(duì)甘草化學(xué)成分影響研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2013，48(10):768－772.

［6］孫付軍，周 倩，王春芳，等.甘草炮制前后藥效學(xué)比較［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(14):115－118.

［7］伏秦超，王 鋼，趙 樂(lè).HPLC檢測(cè)蜜炙甘草中主要成分含量的研究［J］.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26(4):587－589

［8］Wang D，Wong HK，F(xiàn)eng YB ，et al.Liquiritigenin exhibits antitumour action in pituitary adenoma cells via Ras/ERKs and ROS.dependent mitochondrial signalling pathways［J］.J Pharm Pharmacol，2014，66(3):408－ 417.

［9］Suh KS，Rhee SY，Kim YS，et al.Protective effect of liquiritigenin against methylglyoxal cytotoxicity in osteoblastic MC3T3.E1 cells［J］.Food Funct，2014，5(7):1432－1440.

［10］Chen M，Liu L，Chen X.Preparative isolation and analysis of alcohol dehydrogenase inhibitors from Glycyrrhiza uralensis root using ultrafiltration combined with high.performance liquid chromatography and high.speed countercurrent chromatography ［J］.J Sep Sci，2014，37(13):1546－1551.