子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜組織中DLL4和VEGF表達(dá)水平及其臨床意義分析

李 清，周 暢

(1.江蘇省蘇州市相城人民醫(yī)院婦產(chǎn)科;2.江蘇省蘇州市立醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇蘇州 215130)

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)為臨床婦科常見的良性疾病，然而其病變部位廣泛，通常累及盆腔以及卵巢等部位，導(dǎo)致盆腔發(fā)生黏連，性交疼痛以及痛經(jīng)不孕等癥狀［1－3］，并可能發(fā)生浸潤，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等情況，嚴(yán)重?fù)p害患者的身體健康和生活質(zhì)量。此疾病的發(fā)病機(jī)制還未闡明，近年來的深入研究，認(rèn)為血管內(nèi)皮生長因子能夠促進(jìn)血管生成，血管調(diào)控重要機(jī)制包括Notch通路中的配體 Delta-like ligand4［4］;本次研究通過免疫組化SP聯(lián)合對(duì)45例EMs的異位子宮內(nèi)膜，42例在位的內(nèi)膜以及33例正常內(nèi)膜中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)以及細(xì)胞跨膜Notch配體4蛋白(DLL4)的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)二者相關(guān)性進(jìn)行分析，研究兩種蛋白在EMs發(fā)展中的意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 病例組 本著隨機(jī)原則選取我院在2010年4月—2013年1月由于卵巢囊腫并進(jìn)行腹腔鏡手術(shù)并且通過病理診斷為子宮內(nèi)膜異位癥患者共45例，選擇其中子宮內(nèi)膜發(fā)生異位(A組)，宮腔內(nèi)膜在位(B組)42例(由于3未婚無性生活所以未取)。按照1987年美國生育協(xié)會(huì)修訂標(biāo)準(zhǔn)對(duì)患者進(jìn)行分級(jí):A組Ⅰ～Ⅱ期20例，Ⅲ～Ⅳ期25例;B組Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期23例。

1.1.2 對(duì)照組 選取同期由于不孕并進(jìn)行宮腔鏡檢查的33例患者(C組)，將其宮頸的正常內(nèi)膜組織取出。

1.1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) A、B、C三組患者處于月經(jīng)周期中的子宮內(nèi)膜生長期，患者年齡之間比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，因此具有可比性。在研究前患者均知情和同意，并且無其他內(nèi)外科疾病，有規(guī)律的月經(jīng)周期28～34 d，無子宮腺肌癥，排除其他類型婦科疾病和內(nèi)分泌疾病以及生殖道炎癥，6個(gè)月期間無激素治療。

1.2 研究試劑 北京博奧森生物工程公司以及美國SANTA CRUZ公司生產(chǎn)的兔抗人DLL4，VEGF多克隆抗體(濃度為1∶100)，由北京中杉生物工程公司生產(chǎn)的DAB試劑顯色盒以及SP9000試劑盒。

1.3 研究方法 通過使用SP法對(duì)DLL4和VEGF蛋白進(jìn)行檢測(cè)，使用0.9%濃度的NaCl注射液對(duì)標(biāo)本中的血液等雜質(zhì)進(jìn)行沖洗，使用10%的甲醛進(jìn)行固定，隨后脫水，石蠟包埋，以4μm標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行切片，在60℃的烤箱中烘烤2 h，隨后進(jìn)行脫蠟，水化，修復(fù)抗原，阻斷內(nèi)源性過氧化酶，顯色，酒精梯度脫水，使用二甲苯透明并用中性樹膠封片。所有過程嚴(yán)格按照說明進(jìn)行。PBS代替一抗試劑作為陰性對(duì)照，采用已知的陽性切片作為陽性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 在顯微鏡下對(duì)切片進(jìn)行觀察，DLL4與VEGF的陽性表達(dá)均以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色以及黃色顆粒標(biāo)準(zhǔn)。使用電腦圖像分析系統(tǒng)，選取符合隨機(jī)原則，選出5個(gè)陽性非重疊的高倍視野(×400)，并測(cè)定積分光密度(IOD)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本次研究的數(shù)據(jù)處理采用SPSS16.0軟件。用(±s)表示計(jì)量資料，數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，有方差齊性。多組間比較使用單因素方差分析，多重比較則使用LSD-t檢驗(yàn)。此外，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行A、B組的不同時(shí)期的比較，使用Pearson進(jìn)行數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析。顯著性水準(zhǔn)α =0.05。

2 結(jié)果

DLL4以及VEGF都在子宮內(nèi)膜腺體的上皮細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)，間質(zhì)細(xì)胞中胞質(zhì)表達(dá)極少，因此不計(jì)入 IOD的分析計(jì)算。

2.1 VEGF和DLL4表達(dá)水平比較 行方差分析發(fā)現(xiàn)，各組患者DLL4和VEGF水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中以A組最高，B組其次，C組最低，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表 1。

表1 VEGF和DLL4表達(dá)水平比較(±s)

表1 VEGF和DLL4表達(dá)水平比較(±s)

注:與 C 組比較，*P ＜0.05;與 B 組比較，▲P ＜0.05。

組別 例數(shù) DLL4/μg·L－1 VEGF/ng·L －1 A 組 45 143.72±11.39▲＊ 149.36±9.13▲＊B 組 42 112.81 ±10.64* 121.61 ±6.28*C 組 33 91.42 ±8.47▲ 104.39 ±6.23▲F 238.743 267.921 P 0.000 0.000

2.2 VEGF和DLL4相關(guān)性 對(duì)三組患者DLL4和VEGF水平行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)A組和B組患者的2種蛋白的表達(dá)具有顯著一致性(P＜0.05)，而 C組無明顯相關(guān)性。見表2。

表2 VEGF和DLL4表達(dá)水平相關(guān)性分析(±s)

表2 VEGF和DLL4表達(dá)水平相關(guān)性分析(±s)

組別 例數(shù) DLL4/μg·L－1 VEGF/ng·L－1r P A組45 143.72 ±11.39 149.36 ±9.13 0.854 0.000 B 組 42 112.81 ±10.64 121.61 ±6.28 0.729 0.000 C組33 91.42 ±8.47 104.39 ±6.23 0.142 0.346

2.3 A、B兩組不同分期的兩種蛋白表達(dá)比較 在A組中兩種蛋白Ⅰ～Ⅱ期的水平顯著低于Ⅲ～Ⅳ期(tDLL4=－7.374，P=0.000，tVEGF=－4.773，P=0.000)，B 組中的兩種蛋白Ⅰ～Ⅱ期的水平顯著低于Ⅲ～Ⅳ期(tDLL4=－5.557，P=0.000，tVEGF=－4.273，P=0.000)。見表 3。

表3 不同分期時(shí)VEGF和DLL4表達(dá)水平比較(±s)

表3 不同分期時(shí)VEGF和DLL4表達(dá)水平比較(±s)

注:組內(nèi)與Ⅲ～Ⅳ期比較，*P＜0.05。

組別 例數(shù) DLL4/μg·L－1 VEGF/ng·L －1 A 組 Ⅰ ～ Ⅱ期 20 135.62±5.69* 144.91±5.16*Ⅲ ～ Ⅳ期 25 152.30 ±7.95 153.27 ±8.63 B 組 Ⅰ ～ Ⅱ期 19 106.68±7.48* 119.20±4.51*Ⅲ ～ Ⅳ期23 122.37 ±8.39 126.33 ±5.24

3 討論

異位內(nèi)膜細(xì)胞在宮外生長的主要原因?yàn)樾律难芩峁┑难汗?yīng)，EMs在近年來其血管新生作用和機(jī)制受到廣泛關(guān)注;近年來發(fā)現(xiàn)DLL4是新型哺乳動(dòng)物中的Notch信號(hào)途徑主要配體。根據(jù)相關(guān)研究表明，DLL4對(duì)血管內(nèi)皮頂端細(xì)胞形成能夠起到抑制的作用，并且可以對(duì)細(xì)胞的密度，行為方式和位置進(jìn)行調(diào)整。從而對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞分化以及血管網(wǎng)形成起到促進(jìn)的作用。史淑紅等［5］根據(jù)RNA體外的干擾術(shù)對(duì)DLL4的表達(dá)進(jìn)行下調(diào)，觀察到血管內(nèi)皮細(xì)胞其遷移，增生和血管網(wǎng)的形成顯著被抑制;結(jié)果顯示DLL4是引導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行成熟分化重要因素;過去DLL4被認(rèn)為在血管內(nèi)皮細(xì)胞中特異表達(dá)，根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌和肺癌等癌癥中DLL4表達(dá)水平均較高，并且與分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)［6－7］;然而其在EMs很少被人關(guān)注和報(bào)道，通過本次研究，在異位內(nèi)膜和在位的內(nèi)膜的腺體上皮細(xì)胞中表達(dá)呈現(xiàn)陽性，且表達(dá)量顯著大于對(duì)照組(P＜0.05)，并且在異位內(nèi)膜的表達(dá)水平顯著大于在位內(nèi)膜(P＜0.05)，隨著異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜分期的增高其水平逐漸升高(P＜0.05)。表明其與EMs的發(fā)展有著很緊密的聯(lián)系。

VEGF是一種功能最強(qiáng)的促血管形成因子，本次研究表明:在異位內(nèi)膜表達(dá)水平明顯高于在位內(nèi)膜，在位內(nèi)膜的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。同葉青［8］之前的報(bào)道結(jié)果相同。表明VEGF表達(dá)高水平同EMs中的血管發(fā)生之間關(guān)系緊密。且其水平表達(dá)隨著病情分期的發(fā)展而逐漸升高(P＜0.05)。因此表明VEGF在EMs的發(fā)展中有著重要作用。

此次研究的過程中觀察到VEGF和DLL4可共同參與EMs的發(fā)生以及發(fā)展過程。根據(jù)研究說明，VEGF促進(jìn)DLL4的表達(dá)，DLL4為VEGF的下游通路的負(fù)性調(diào)控因子，對(duì)血管的出芽以及形成分支起到了反饋性抑制，增加了血管的灌注并且減少了血管的密度。由此對(duì)EMs的發(fā)展過程進(jìn)行推測(cè)，兩種蛋白互相反饋，可達(dá)到相對(duì)平衡的狀態(tài)，對(duì)新生血管的形成以及分化起到了促進(jìn)作用。保證病灶的血液供應(yīng)，對(duì)疾病的發(fā)展起到促進(jìn)的作用。

研究表明:對(duì)DLL4進(jìn)行抑制能夠?qū)o功能的血管生成起到促進(jìn)作用［9］，文獻(xiàn)報(bào)道運(yùn)用DLL4特異性抗體對(duì)腫瘤進(jìn)行處理，觀察到腫瘤內(nèi)的DLL4-Notch通路的阻斷能夠產(chǎn)生許多無功能的新生血管，從而抑制腫瘤的發(fā)展［10］。主要抑制腫瘤新生血管的形成，對(duì)之前生成的血管無明顯影響。據(jù)此推斷:在臨床治療EMs的新靶點(diǎn)可能轉(zhuǎn)變?yōu)镈LL4-Notch，并且表明EMs靶向治療中DLL4抑制劑有良好的前景，并且其可靠性待進(jìn)一步考證和研究。

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