自噬對多發性骨髓瘤細胞增殖的影響

高靈素，虞國慧

(安徽省六安市人民醫院，安徽六安 215004)

多發性骨髓瘤(MM)是造血系統惡性腫瘤，異常的漿細胞能分泌大量異常的單克隆免疫球蛋白［1］，正常途徑難以降解異常克隆的免疫球蛋白，異常M蛋白會聚集在細胞的內質網內。能誘導細胞內產生未折疊蛋白反應(UPR)，即大量未折疊或錯誤折疊的蛋白在內質網產生，進而會導致細胞死亡。誘導細胞自噬(autophagy)則是MM細胞保護其免受未折疊蛋白影響的重要途經之一［2-3］，本研究觀察體外經自噬誘導及阻斷劑作用后MM細胞增殖能力的變化，并檢測自噬相關調節基因的變化，從不同角度探討MM的發病機制。

1 材料和方法

1.1 細胞株來源及細胞分組 本實驗使用細胞株均由蘇州大學邱玉華教授惠贈;實驗過程中，U266細胞隨機分為正常培養細胞組、雷帕霉素處理組、3-MA處理組，對照組如下:無血清培養條件下的U266細胞組、無血清培養條件下雷帕霉素處理U266細胞組、無血清培養條件下3-MA處理U266細胞，正常培養和無血清條件下培養的Jurkat細胞。雷帕霉素和3-MA藥物濃度均為1 000 μg·L-1。

1.2 CCK8法檢測細胞活力 調整細胞密度為2×108·L-1，接種于 96 孔培養板，立即加入 10 μL CCK-8試劑，后分別間隔24 h加入CCK-8試劑，直至培養4 d，加入試劑后均繼續在培養箱內培養3 h，取出后在450 nm波長處測定各實驗分組的吸光度，根據吸光度繪制增殖曲線。

1.3 細胞凋亡水平及自噬泡測定 U266細胞以2×108·L-1密度接種于培養瓶，按實驗分組分別加入雷帕霉素及3-MA處理，于正常培養的24及72 h收集細胞，采用流式細胞術檢測細胞凋亡水平。培養96 h后離心洗滌去除處理因素，繼續培養48 h，檢測各實驗組細胞內凋亡水平。同時檢測對照組U266細胞內凋亡率。Atg8為自噬小體形成的第2個泛素樣蛋白結合系統，可以特異性的與MDC結合，因此，我們通過熒光染色進行標記，在熒光顯微鏡下可見漿細胞核周區域點狀結構熒光。培養24及72 h時均取少量U266細胞進行MDC染色，孵育15 min后置于熒光顯微鏡下觀察染色情況。

1.4 免疫印跡分析細胞內LC3蛋白水平 按實驗分組分別收集培養24及72 h的U266細胞，按操作說明提取細胞內總蛋白，統一調整所提取的各組蛋白濃度至4 g·L-1。每孔加入60 μg蛋白進行蛋白凝膠電泳(SDS-PAGE)。設置電泳的電壓為恒壓70 mV，放入電泳槽內，直至蛋白電泳至分離膠底部;取出凝膠，按順序放置好纖維素膜，在90 mV條件下在轉移槽內轉移40 min。取下纖維素膜，脫色搖床上用含5%的脫脂奶粉的TBST封閉1 h。TBST清洗3次，將一抗至1∶1000的濃度(LC3∶兔抗人IgG)，在4℃條件下孵育過夜，然后再次用TBST清洗3次，稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1000)與纖維素膜作用1 h，反應后TBST清洗共3次。使用化學發光法顯影于X膠片上。樣本的免疫印跡條帶均與同一樣本的內參比較后作統計學分析。

1.5 自噬相關基因 mtor、Beclin1、Atg5分析 分別收集培養24及72 h的各實驗組細胞，采用RNeasy kit(Qiagen)試劑盒提取U266細胞RNA樣本，設置反應條件，每次取試驗各組細胞1 μg RNA進行逆轉錄，按同等劑量cDNA進行PCR反應。取PCR產物4 μL，加入指示劑 5 × Loading Buffer 2 μL，120 V，100 mA下進行凝膠電泳30 min。結束后進行凝膠成像儀成像并保存結果。引物序列由上海生物工程公司設計并合成，以β-actin為內參(表1)。操作按說明進行，PCR共32個循環。

1.6 統計方法 數據以均數±標準差表示，應用SPSS 17.0軟件進行分析。細胞增殖及細胞凋亡率采用t檢驗，以α=0.05為檢驗水準。

表1 引物序列及片段大小

2 結果

2.1 自噬水平變化對MM細胞增殖的作用 根據繪制的增殖曲線我們發現，無血清培養條件下Jurkat細胞增殖基本停止，顯著低于正常對照及無血清培養U266細胞。我們的實驗結果表明，3-MA或雷帕霉素處理組細胞的增殖水平與對照組相比，在培養24及72 h有顯著區別(P＜0.05)，故確定實驗時間點為24及72 h。而正常條件下培養24 h，雷帕霉素及3-MA處理的細胞增殖水平有呈上升趨勢，較未處理組緩慢。但隨著培養時間延長至72 h，處理組細胞增殖處于緩慢上升趨勢(圖1)。

2.2 藥物處理對自噬水平的影響 自噬泡可以通過熒光染色后在電鏡下觀察到，如圖所見，正常培養U266細胞核周圍環繞藍色點狀熒光，加入雷帕霉素處理24 h后細胞核周熒光增多，表明與正常培養組相比自噬水平有增多。自噬抑制劑3-MA作用24 h后U266細胞核周熒光減少，提示自噬泡減少，自噬水平減低。而繼續延長培養時間后觀察發現，培養72 h雷帕霉素處理細胞內自噬水平明顯增高。而延長培養時間至72 h 3-MA處理組細胞內核周藍色點狀熒光同樣增多(圖2)。

2.3 U266細胞凋亡水平檢測 加入雷帕霉素或3-MA的U266細胞培養24 h后檢測凋亡水平。我們發現各組細胞凋亡水平均升高，分別為1.7% ±0.2%(對照組);16.8% ±0.61%(3-MA 處理組);19.1% ±1.0%(雷帕霉素處理組);且 P ＜0.01，延長培養時間至72 h，雷帕霉素處理組U266細胞凋亡水與培養24 h無明顯變化16.9% ±0.46%，而3-MA處理組凋亡水平明顯下降9.0% ±0.70%(圖3)。

2.4 正常培養U266細胞內LC3蛋白表達 LC3蛋白為自噬相關蛋白，在自噬泡形成過程中始終可檢測到，當哺乳動物發生自噬時，隨著自噬泡的形成，細胞內LC3的含量明顯增加。本實驗經蛋白質印跡法檢測發現U266細胞內存在低水平表達的LC3蛋白，并發現其高于正常培養的Jurkat細胞(圖4)。

2.5 藥物處理后正常培養下U266細胞自噬相關基因表達的影響 正常培養條件下U266細胞培養瓶內加入雷帕霉素培養24 h，通過RT-PCR檢測發現mtor基因表達水平上升，而加入3-MA培養24 h后mtor基因表達水平也同樣呈上升表現。而培養至72 h正常培養組、雷帕霉素處理組及3-MA處理組mtor基因表達水平繼續上升(圖5)。同時檢測Atg5及Beclin1基因水平發現，Atg5基因表達趨勢與mtor基因一致(圖6)。而3-MA處理細胞組內Beclin1基因表達水平均較其余2組低(圖7)。內參如下(圖8)，各組數據均與同一內參進行比較。

3 討論

多發性骨髓瘤細胞是一種惡性漿細胞病，其腫瘤細胞起源于骨髓中的漿細胞，其特征為骨髓漿細胞異常增生伴有單克隆免疫球蛋白或輕鏈(M蛋白)過度生成，極少數患者可以是不產生M蛋白的未分泌型MM。在一般情況下細胞內存在的異常蛋白能導致細胞死亡，細胞能通過多種途徑降解蛋白，研究發現自噬具有降解異常蛋白的能力。自噬可以降解胞內堆積的毒性蛋白質，故而我們推斷自噬是維持多發性骨髓瘤細胞發生、發展的重要因素。已有研究證實抗腫瘤藥物通過自噬途徑起作用［4］。但同時研究發現，自噬對細胞的生存和增殖起到不利的作用，過度的自噬能導致細胞死亡［5］。

研究資料發現，Hoang等研究了MM細胞株中的自噬情況，結果表明其中存在一定水平的自噬現象［6］，當細胞暴露于蛋白酶體抑制劑硼替佐米、受到內質網應激，或用mTOR抑制劑處理時，細胞內的自噬水平會上升，幫助在上述環境下維持細胞長期生存。同樣的，研究證明饑餓條件同樣可抑制mTOR蛋白的活化，進而誘導細胞自噬發生，通過對自身細胞內各種營養元素物質的降解來維持細胞增殖［7］。雷帕霉素為現有的mTOR蛋白抑制劑，研究發現，培養液內加入雷帕霉素可誘導自噬的發生［8-9］。同時研究發現，自噬過程中有Ⅰ/Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶系統參與。3-MA可通過抑制Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶(classⅢPI3K)來抑制自噬的發生，所以該藥物廣泛作為自噬抑制劑使用。然而又有研究發現，如果在正常培養條件下延長3-MA和骨髓瘤細胞的作用時間，其自噬水平反而呈明顯上調狀態［10］。這可能是由于3-MA同時對I型PI3K系統也有抑制作用，起到誘導自噬的作用。故3-MA對自噬起到抑制及誘導的雙重作用。

多發性骨髓瘤細胞內存在基礎自噬，為了研究其對細胞增殖的作用，我們繪制了饑餓培養條件下U266細胞及Jurkat細胞的增殖曲線。結果發現在體外饑餓條件下U266細胞仍具有增殖能力直至培養72 h。而對照組Jurkat細胞的增殖成低平曲線，基本停止增殖;在血清培養液條件下加入雷帕霉素及3-MA，細胞增殖水平較未加入試劑的U266細胞增殖水平明顯低下。

本實驗研究了 mtor、Atg5及 Beclin1基因在U266細胞內的表達。雷帕霉素可上調細胞內自噬，而3-MA在處理24 h時對自噬起到抑制的作用，到培養72 h，檢測自噬相關基因表達我們發現示3-MA反而對自噬起到誘導作用。這就證明了培養時間延長到一定程度，3-MA對I型磷脂酰肌醇3磷酸激酶系統的抑制起主導作用，誘導自噬發生。Beclin1蛋白是Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶系統的組成部分，故Beclin1基因與Atg5基因相比，3-MA處理組培養24及72 h后Beclin1基因表達水平均較正常培養及雷帕霉素處理組低。故而我們可以得出結論，提示在培養過程中3-MA對Ⅲ型PI3K系統的抑制作用一直存在，故而導致Beclin1基因表達水平下降。

雖然我們的實驗發現正常培養條件下雷帕霉素及3-MA對細胞內自噬的影響不同，但多發性骨髓瘤細胞的增殖曲線為相同趨勢。故可推測過度誘導自噬及抑制自噬均可能造成細胞死亡，抑制細胞增殖。接下來本實驗研究細胞內凋亡水平。

自噬與凋亡均屬于程序性細胞死亡范疇，但越來越多的研究發現二者在某些情況下存在著聯系［11-12］，有著相互協同發展或拮抗的作用。本實驗發現雷帕霉素及3-MA處理24 h后骨髓瘤細胞內內凋亡水平均升高。但是到培養72 h時，3-MA處理的細胞組內凋亡水平較培養24 h時下降。表明培養時間延長，培養液內營養物質逐漸降解，接近饑餓環境，3-MA通過對抗細胞凋亡來延長細胞生存。

綜上所述，自噬可促進MM細胞增殖，并維持其長期生存，但自噬抑制劑、阻斷劑如雷帕霉素及3-MA也可同時抑制MM細胞增殖，促進細胞凋亡。證實自噬對MM細胞生存具雙重作用，或雙向調節左右，有必要進一步深入探討，可能對多發性骨髓瘤的治療提供新的治療靶點。

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