中藥腦脊液藥理學研究及應用進展

章亞兵，汪 寧

(1.安徽中醫藥大學，安徽合肥 230031;2.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 210051)

通過體外藥理實驗研究中藥及復方制劑藥理作用，由于中藥成分的復雜性［1］，體外實驗對培養體系的干擾因素大，易受到中藥中的滲透壓、pH、鞣酸及離子等成分的干擾，影響到了實驗結果的準確性。日本學田代真一提出了中藥血清藥理學方法的概念［2］，中藥血清藥理學是指將中藥或中藥復方經口給動物灌服一定時間后采集動物血液，分離血清，用含有藥成分的血清進行體外實驗的一種實驗技術。作為一種改良的中藥體外實驗方法，中藥血清藥理學研究排除了中藥粗制劑直接加入反應系統所帶來的干擾，有利于發現體外沒有作用而體內有作用的藥物，相對真實地反映藥物的整體作用［3］。但是機體在服用一定劑量的某種藥物后，藥物的成分或代謝產物經過血液循環到達其作用的靶器官，而最終與靶器官的細胞上的作用靶點直接接觸的并不是含藥血清，而是含有一定濃度活性成分的組織液［4］。在機體產生的組織液中，腦脊液是常見的也是一種十分重要的組織液。但是由于血腦屏障(Blood-brain barrier，BBB)作用，使得腦脊液的成分與血清的成分，不論是生理性還是藥物(代謝)成分都存在差異。血腦屏障是存在于腦組織和血液之間的一個復雜的細胞系統，控制血腦兩側的物質轉運，從而保證中樞神經組織內環境的穩定［5］。BBB受損是腦血管疾病發生、發展的主要原因之一［6］。可通過代謝進入血清的中樞神經藥物有效成分因受BBB的選擇性通過作用是否能夠達到腦脊液中，發揮中樞神經保護作用，是研究者們對中藥復方進行藥效學研究時面臨的難題。近來有學者提出用含藥腦脊液通過體外實驗用于研究中樞神經系統藥物的藥理作用。以中藥復方的含藥腦脊液來代替含藥血清通過體外實驗研究中藥的藥理作用及確定中藥的有效成分將可能縮小研究范圍，突出重點，并可避免血清中復雜成分的干擾，更能體現有效成分的藥理作用，增加有效成分研究的針對性［7－10］。

1 腦脊液藥理學方法的提出

中藥腦脊液藥理學是實驗動物給予一定劑量的中藥后，通過采集動物含藥腦脊液作為受試藥進行藥理研究的實驗方法。腦脊液是存在于各腦室、蛛網膜下腔和脊髓中央管內的無色透明液體，由腦部特殊的毛細血管網產生。而血腦屏障是存在于腦部的血漿與腦細胞之間的屏障，其中存在著緊密連接蛋白等特殊生物學結構，僅僅分子質量較小的脂溶性物質及氣體分子才能順利通過進入腦脊液。其他化學物質，即使是對腦組織有治療作用的藥物也有可能被認為是對大腦內部環境產生不利影響而阻擋在BBB以外，這樣才能保證維持大腦內生理環境相對穩定和中樞神經系統的正常結構與功能［11－13］。BBB對于腦部正常的生理活動起著至關重要的作用，但是由于其同時能夠阻止藥物自由進入腦組織，也增加了對中樞神經系統(CNS)疾病的治療難度，對于新藥篩選和藥理藥效的保護作用及其機制的闡述同樣增加了難度。鑒于此，在對新藥篩選和藥理藥效的保護作用及其機制的闡述時，中藥的有效成分是否能夠通過BBB作用于腦部神經細胞發揮藥理作用是我們實驗的關鍵。梅建勛等［14］提出中藥腦脊液藥理學的實驗方法，并研究了這一方法對星形膠質細胞的離體作用。在家兔灌胃給予中藥后，采集腦脊液并作用于正常星形膠質細胞后發現，正常星形膠質細胞在含腦脊液培養基中培養狀態明顯優于含相同濃度血清培養基［15］，表明中藥腦脊液方法優于血清藥理學方法，并使用此方法研究了腦益智方的含藥腦脊液對神經元細胞的保護作用［16］。

2 中藥腦脊液藥理學的現狀

2.1 中藥腦脊液藥理學的應用 在具體試驗時，如何造模以及細胞損傷指標的選擇是學者們根據研究對象的不同而具體選擇，一般通過采集含藥腦脊液后作用于經過加入化學物質如谷氨酸［17］、KCl［18］、過氧化氫［19］、連二亞硫酸鈉［20］等進行造模的細胞株，通過考察細胞的各類指標研究其保護作用及作用機制。選擇合適的化學物質造模后，細胞的各項指標如膜通透性［21］、氧化應激水平［22］、能量代謝［23］、鈣超載程度［24］、各類基因、蛋白的表達均會發生變化［25］，通過對這些指標的檢測可確認含藥腦脊液是否有保護作用，以及通過一系列指標的測定找出其作用靶點。在膜通透性檢測方面，可使用AO/EB染色，臺盼蘭染色，培養上清液中LDH濃度等指標進行試驗;在衡量細胞氧化應激水平方面，NO濃度、SOD活性、MDA濃度、ROS濃度均是常用參數;在能量代謝水平方面，ATP酶活性檢測、羅丹明123染色利用流式細胞術分析等試驗是良好的方法;在鈣超載程度衡量時可使用細胞內游離鈣離子濃度檢測，Westen-blotting方法檢測鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)比值衡量磷酸化程度等方法。在凋亡蛋白表達方面，c-fos和c-jun、凋亡基因bax、bcl-2 和 caspase-3 均是不錯的選擇［26－30］。由于腦脊液是體內重要的神經營養液，通過給藥后可從下列方面說明可應用于藥效學的研究。首先，含藥腦脊液中可能含有效應物質，可應用于中樞神經系統藥物的體外藥效學研究。葉光華等［31］證明了清心開竅方含藥腦脊液對αβ25-35損傷的PC12細胞具有保護作用。李福東等［32］發現PC12細胞在開心散含藥腦脊液無血清培養基中也能夠生長，并且具有含藥腦脊液濃度相關性。開心散復方中的有效成分能夠經過吸收、轉化并通過BBB進入腦部發揮藥效。張曉艷等［33］通過研究發現，清心開竅方含藥腦脊液能夠明顯提高KCL所致損傷的PC12細胞活力，在AD的治療效果是顯著的。上述研究成果從不不同方面說明了含藥腦脊液可改善損傷細胞的保護作用，為臨床用藥提供了依據，為保護機制的研究奠定了基礎。其次，含藥腦脊液中新化學物質研究可闡述中藥復方的物質基礎。孫志翠等［34］在相同色譜條件下比較了各組的HPLC指紋圖譜，初步鑒定出了腦脊液成分、復方成分以及代謝產物，證實了給藥后腦脊液中出現了復方中的有效成分。李越峰等［35］利用HPLC法比較大鼠給藥后血中以及腦脊液中的移行成分，確認了復方中的有效成分為辛弗林、芍藥苷、柴胡皂苷C及甘草次酸的混合物。汪寧等［36］通過研究通竅活血顆粒家兔灌胃后利用氣相色譜法研究腦脊液移行成分，并且發現了通竅活血顆粒復方制劑中君藥麝香所含成分麝香酮，并提出可定量測定其含量以此作為復方制劑質量標準之一。上述研究表明，含藥腦脊液的藥效學結果均有物質基礎依據，是藥效學的重要佐證。另外，腦脊液的成分變化引起腦內其他生物活性物質變化也是研究的熱點。謝寧等［37－38］通過灌胃方式給予家兔地黃飲子水提取物后抽取家兔腦脊液并用來研究了含藥腦脊液對β-淀粉樣蛋白(αβ25-35)所致PC12損傷細胞即早基因c-fos和cjun、凋亡基因bax、bcl-2和caspase-3表達作用的影響。結果顯示 c-fos、c-jun、bax和 caspase-3表達被抑制，只有bcl-2的表達是提高的，含藥腦脊液可通過引起腦內基因的表達影響神經細胞的生長。

2.2 中藥腦脊液藥理學的關鍵實驗步驟

2.2.1 實驗動物選擇 大小鼠、家兔、犬是我們常用的實驗動物。鄒永杰在對Longa法加以改良，建立小鼠的線栓法永久性大腦中動脈閉塞(MCAO)模型，深入研究了高壓氧預適應對小鼠MCAO模型的腦缺血保護作用［39］。池欣欣用大鼠進行了缺血再灌注大鼠腦損傷的實驗研究［40］。大鼠由于價格低廉、飼養費用低、腦血管解剖結構與高等動物相似、生態學和倫理學等因素考慮［41］，是實驗者常選擇的實驗動物之一。劉聰等通過新西蘭兔灌胃柴黃顆粒后取腦脊液研究了腦脊液中發熱介質的影響［42］。家兔可取得腦脊液量遠大于大小鼠，雖然費用較之稍高，為保持理化、生物特性的一致性，可減少因種群差異產生的免疫反應，提高實驗結果可信度，也是實驗者常用的實驗動物。張升等建立一種新的手術模型，實現對腦脊液(CSF)的多次采集，動物手術存活率為80%，模型成功率為60%［43］，有利于多次累積采集腦脊液，適合用于對腦脊液需求量大的實驗。馬鋒等利用六味地黃丸兔、大鼠、人3種不同種屬動物含藥腦脊液腦脊液對αβ1-40誘導的細胞活力減低有明顯抑制作用，且未發現差異性［44］，提示種群差異不是我們動物選擇的唯一標準。

2.2.2 腦脊液采集 動物的腦脊液體積很少，實驗者應根據自身能力及特點，盡量采取熟練的、可行的獲取方法。楊子等［45］進行了3種采集方法的比較，以選擇可靠的采集方法。第一，經皮穿刺延髓池抽取腦脊液。本方法雖然操作簡單，但是難度太大，未能成功采集合格腦脊液，其原因是采集者不能不能確保進針位置的絕對準確，且不能保證進針深度合適，容易刺穿延髓池。第二，直視下劃破硬脊膜抽取腦脊液。本方法10只大鼠均能采集到清涼腦脊液，但離心后出現8例血性腦脊液，合格率為20%。究其原因，在用手術刀片劃破硬脊膜時極易劃破組織血管，導致采集失敗，且待腦脊液流出后再用微量注射器采集，在流出和采集的間隔極易被污染。第三，直視下經硬脊膜穿刺微量進樣器抽取腦脊液。本方法100%采集到清涼合格的腦脊液，且每只能采集超過100 μL。本方法能夠成功采集足量腦脊液的原因為，在直視下采集者可用微量注射器直接刺入枕大孔采集，不易產生偏差，且腦脊液未流出之前不與外界接觸，不容易產生污染，加之腦脊液只會流向微量注射器，不會產生損失。馬偉等［46］采取了直視下經硬脊膜穿刺微量進樣器抽取腦脊液的方法，通過枕大孔共抽取了30只SD大白鼠，3只未取出，5只因出現混血失敗，其余22只均成功抽出，平均76 μL，成功率為73%，并且其中有18只腦脊液超過100 μL。另通過枕大孔取了50只家兔，其中2例未取出，4例出現混血失敗，其余均成功采集，平均700 μL，成功率88%。上述結果表明兩組實驗者采取的直視下經硬脊膜穿刺微量進樣器抽取腦脊液的方法可行，一組采集者成功率略低的原因可能在于采集手法及熟練程度存在差異，并不表明采集方法不可靠，本方法為目前采集者的首選方法。

2.2.3 腦脊液的保存 腦脊液離體后，可立即實驗，或者短期－20℃保存，一般不超過30 d，以防變性。夏吉榮等［47］通過比較腦脊液和血清中共同含有的化學物質神經元特異性烯醇化酶(NSE)，發現在相同溫度下腦脊液中的NSE穩定性較差，說明腦脊液對離體后的化學物質保護作用更差。另外發現腦脊液中的NSE測定值比文獻中的測定值低，可能是實驗后放置的時間過長導致NSE分解。通過以上實驗結果，初步表明，標本保存溫度、時間可能是NSE穩定性的重要影響因素，這就要求實驗者的盡量縮短采集時間，并在采集結束后盡快于－20℃保存。

3 中藥腦脊液藥理學的總結和展望

中藥腦脊液藥理學是近年應用于中樞神經疾病與治療藥物研究的熱點，其模擬了中藥經過加工、給藥、吸收、代謝后在腦部的分布情況，為中藥及其成方制劑研究提供了良好的離體實驗方法，有利于中樞神經系統藥物的保護作用、作用機制和藥效物質基礎研究。隨著方法學的進一步完善，其必將適用于更加廣泛的研究領域中。

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