高效液相色譜法測定地塞米松植入劑的有關物質

任翠麗，夏倫洋，尹情勝，王世亮，3，吳永貴，周春霞

(1.合肥工業大學控釋藥物研究室;2.安徽中人科技有限責任公司;3.安徽四維藥業有限公司，安徽合肥 230009;4.安徽醫科大學第一附屬醫院腎內科，安徽合肥 230022)

地塞米松為糖皮質激素類藥物，臨床主要用于替代療法、自身免疫性疾病、過敏性疾病、嚴重感染、抗休克、血液系統疾病等。本研究小組研發的新劑型新產品—地塞米松植入劑，該植入劑體積較小(呈圓柱體，直徑0.8 ～0.9 mm，長 2 ～4 mm)，為白色或類白色，用于治療腎病綜合證，可通過一定的技術手段植入腎囊，藥物到達局部后，緩慢釋放，周期長達2個月。這樣局部藥物濃度較高，殺死病灶，全身血藥濃度較低，使不良反應大大的減少［1－3］。這樣可以避免或減少地塞米松傳統給藥的方式導致的全身不良反應(滿月臉、水牛背、向心性肥胖、高血壓、低血鉀等)。本文查閱了一些相關文獻［4－13］并在相應的實驗基礎上，建立了高效液相色譜法測定地塞米松植入劑的有關物質。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 電子天平(METTLER TOLEDO，型號XA105)、數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，型號KQ－100DE)、高效液相色譜儀(日本島津，型號LC－15C)。

1.2 試藥 地塞米松植入劑(批號:20131225，20140113，20140216，標示量 2 mg)、對照品地塞米松、倍他米松購于中國藥品生物制品檢定所(批號分別為 100129－200804、100118－200803)、甲醇(色譜純，SIGMA －ALDRICH.CO)、乙腈(色譜純，Product of Tedia United states of America)、聚乳酸(安徽中人科技有限責任公司合成組提供，分子量約17000，批號20131228)、聚乙二醇6000(北京市海淀區精細化工廠)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱:天津蘭博 Kromasil-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm，S/N:09253924);流動相:乙腈—水(28∶72，V/V)，流速:2.0 mL ·min－1，檢測波長:240 nm，柱溫:35 ℃，進樣量:20 μL，取“2.2.4”項下的對照溶液 20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，出峰順序依次為倍他米松峰與地塞米松峰，分離度應符合要求［14］。

2.2 溶液的配制

2.2.1 制劑溶液配制 取本品約51 mg(相當于地塞米松5 mg)，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超聲處理30 min，取出，放冷，加甲醇定容至刻度并搖勻，過濾，作供試品溶液。

2.2.2 地塞米松儲備溶液 取地塞米松標準品約10.00 mg，精密稱定，置于20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成0.5 mg·L－1的儲備溶液。

2.2.3 倍他米松儲備溶液(雜質溶液) 精密稱取倍他米松標準品10.00 mg于20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成0.5 mg·L－1的儲備溶液。

2.2.4 0.5%自身對照品溶液(5 mg·L－1) 精密移取“2.2.2”項和“2.2.3”項溶液各 1 mL 于 100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.3 檢測波長的確定 分別取地塞米松儲備溶液和雜質倍他米松溶液適量，在200～600 nm波長范圍內掃描。地塞米松在240 nm處有最大吸收，而雜質倍他米松在此處也有吸收，并使用本實驗中的色譜條件，使原料藥及其雜質能有效分離。因此選240 nm為本品有關物質檢查的檢測波長。

2.4 空白輔料干擾實驗 按制劑處方比例取各輔料適量(約88 mg)，混勻。置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超聲處理30 min，取出，放冷，加甲醇定容至刻度并搖勻，過濾，取續濾液20 μL，照上述色譜條件，注入液相色譜儀進行測定，并記錄結果，結果見圖1。結果表明，空白輔料只有溶劑峰，未在主峰及雜質峰處出峰，對主藥及各雜質的測定無干擾。

2.5 線性關系 分別精密量取“2.2.2”項和“2.2.3”項下的溶液各1 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容，搖勻。作線性儲備液(50 mg·L－1)，依次逐步稀釋成 10，5，2.5，1，0.5，0.25，0.1 mg·L－1的溶液。分別精密移取上述溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以濃度(X，mg·L－1)為橫坐標，色譜峰面積(Y)為縱坐標進行回歸，得地塞米松、雜質倍他米松的回歸方程分別為:Y=27 863X －682，r=0.999 8;Y=27 210X －660 ，r=1.0000。表明地塞米松及雜質倍他米松在0.1～10 mg·L－1濃度范圍內，線性關系良好。

2.6 定量限 以信噪比為10∶1的濃度為定量限檢測溶液，進樣20 μL，重復6次。結果地塞米松、雜質倍他米松的最低定量限分別為 1.17、1.04 μg·L－1。

2.7 檢測限 以信噪比為3∶1的濃度為檢測限檢測溶液，進樣20 μL，重復6次。結果地塞米松、雜質倍他米松的最低檢測限分別為 0.39、0.34 μg·L－1。

2.8 重復性 按“2.2.1”項下供試品溶液的配制方法配制6份供試品溶液;取上述1份供試品溶液1 mL于100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制對照溶液;另取系統適用性溶液分別進樣20 μL，記錄峰面積，計算RSD。結果RSD為0.35%，表明該方法重復性良好。

2.9 中間精密度 分別于d 2和d 3重復“2.8”項的操作，記錄峰面積，計算RSD。結果RSD分別為1.15%和2.17%，表明該方法精密度良好。

2.10 穩定性 取供試品溶液、0.5%自身對照品溶液和系統適用性溶液，室溫下放置8 h，分別于0，2，4，6，8 h 進樣 20 μL，記錄峰面積，計算 RSD。結果地塞米松和雜質倍他米松的RSD分別為0.29%，0.78%，表明其溶液在8 h內穩定。

2.11 加樣回收率 精密量取上述“2.2.3”項溶液1 mL于20 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為雜質儲備液(25 mg·L－1);另取地塞米松植入劑9份(每份約相當于地塞米松5 mg)，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超聲處理30 min，取出，放冷，分別加入 0.8、1.0 和 1.2 mL 的雜質儲備液，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液制成含雜質倍他米松量分別為80%、100%和120%的低、中、高三組供試液，每組三份。分別取上述溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。計算各濃度下的回收率和相對標準偏差。

表1 加樣回收率試驗結果

2.12 耐用性 在本實驗方法的基礎上，分別改變流速(1.8 mL·min–1和 2.2 mL·min–1)、柱溫(30℃和40℃)、流動相中乙腈的比例(25%和30%)、不同色譜柱(Kromasil-C18)、取供試品溶液和系統適用性溶液，每個條件分別進樣3次，考察本實驗的耐用性。結果表明，地塞米松、雜質倍他米松的出峰時間、柱效、出峰情況相似，不同條件下測定供試品溶液的有關物質RSD為0.29%，表明本方法耐用性良好。

2.13 專屬性 按如下方法分別對地塞米松原料藥、自制地塞米松植入劑及空白輔料進行破壞性試驗。

2.13.1 酸破壞 稱取樣品適量(約含地塞米松5 mg)，置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超聲處理30 min，取出，放冷后，加1.2 mL濃硫酸，室溫下放置2 min，用 1.0 mol·L－1氫氧化鈉溶液中和至pH值為中性，加甲醇定容至刻度，搖勻，過濾。

2.13.2 堿破壞 稱取樣品適量(約含地塞米松5 mg)，置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超聲處理 30 min，取出，放冷后，加 1.0 mol·L－1氫氧化鈉溶液 0.5 mL，室溫下放置 5 min，用 1.0 mol·L－1鹽酸溶液中和至pH值為中性，加甲醇定容至刻度，搖勻，過濾。

2.13.3 氧化破壞 稱取樣品適量(約含地塞米松5 mg)，置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超聲處理30 min，取出，放冷后，加30%雙氧水2 mL，加甲醇4 mL，60℃水浴下放置2 d，取出放冷后，加甲醇定容至刻度，搖勻，過濾。

2.13.4 高溫破壞 取樣品適量，置150℃烘箱中烘烤2 h，冷卻，稱取適量樣品(約含地塞米松5 mg)，置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超聲處理30 min，取出放冷后，加甲醇定容至刻度，搖勻，過濾。

2.13.5 強光破壞 稱取樣品適量(約含地塞米松5 mg)，置于10 mL量瓶中，加入1 mL乙腈，35℃超聲處理30 min，取出，放冷后，加甲醇定容至刻度，搖勻，過濾。置(4 500±500)Lx的低溫光照儀中3 d，依法檢查。試驗結果表明，樣品在強光破壞3 d、酸破壞、堿破壞、高溫、氧化破壞后，主峰均有所降解，雜質峰均能與主峰分離，說明本法的專屬性較好，見圖2。

2.14 樣品中有關物質的測定 取3批自制樣品(批號:20131225，20140113，20140216)按照“2.2.1”項方法配制供試品溶液，另取倍他米松對照品，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含0.5 mg的溶液，分別精密量取倍他米松1 mL置100 mL各量瓶中，再分別精密加各供試品溶液1 mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。取各供試品溶液及對照品溶液20 μL注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，記錄色譜圖。結果3批樣品總雜質分別為 0.79%，0.87%，0.68%，最大單個雜質分別為 0.015%，0.024%，0.019%，符合有關規定。

3 討論

3.1 流動相的選擇 分別用了甲醇—水(70∶30，V/V)和乙腈—水(32∶68，V/V)［1］作為流動相，但對照溶液中倍他米松與地塞米松的分離度小于1.5。未達到《中國藥典》2010年版二部中提及地塞米松有關物質測定項下的要求。參考文獻［14］資料，經過反復試驗調整流動相中乙腈的比例，當流動相調整為乙腈—水(28∶72，V/V)時，倍他米松與地塞米松的分離度大于1.5，供試品中的雜質峰分離度、對稱因子及保留時間較好。因選用其為流動相。

3.2 流速的選擇 在做初始優化階段選擇時，主要參考了文獻［13］，流速為 1.0 mL·min－1時，樣品分析時間太長，經逐步摸索。選擇2.0 mL·min－1時，柱壓:15～17 MPa，流動相為乙腈—水(28∶72，V/V)，該流動相仍可算做低柱阻良好性能溶劑。因此可選較高流速而不必擔心泵的損壞。研究實踐中觀察到:在進行樣品測定時，內源性干擾組分較少，各組分能有效分離(分離度在1.5以上)。因此流速較高帶來的分離較差的影響，暫時可不考慮。綜合考慮選擇流速2.0 mL·min－1。

3.3 溶劑的選擇 剛開始用流動相溶解樣品時，肉眼觀察樣品溶解不了，有沉淀物，根據《中國藥典》2010年版二部中提及地塞米松略溶于乙醇，用無水乙醇溶解，肉眼觀察不到有沉淀物，但在錄制色譜圖時，發現地塞米松出現雙峰現象;嘗試用乙腈溶解樣品，結果發現地塞米松、倍他米松的分離度及塔板數較低，達不到要求，經摸索，先用少量乙腈(1 mL)超聲溶解樣品，再用甲醇(約9 mL)定容，這樣分離度及塔板數均能符合要求。

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