熱射病大鼠的學習記憶功能研究①

張進進，王恒，房效莉，周立冬，吳士文

熱射病大鼠的學習記憶功能研究①

張進進1，王恒1，房效莉2，周立冬3，吳士文1

目的觀察熱射病對大鼠的學習記憶功能的影響。方法Sprague-Dawley大鼠60只，隨機分為熱射病組(n=44)、手術對照組(n=8)、正常對照組(n=8)。建立熱射病大鼠模型。造模7 d后行Morris水迷宮試驗。前5 d記錄逃避潛伏期；第6天去除平臺，記錄大鼠穿越平臺的次數與在目標象限的停留時間。結果熱射病組死亡16只。熱射病組大鼠逃避潛伏期較其他兩組延長(P＜0.05)，目標象限停留時間及經過平臺次數減少(P＜0.05)。結論熱射病大鼠的學習記憶能力明顯減退。

熱射病；Morris水迷宮；學習記憶；認知功能；大鼠

[本文著錄格式]張進進，王恒，房效莉，等.熱射病大鼠的學習記憶功能研究[J].中國康復理論與實踐,2015,21(3):272-275.

CITED AS:Zhang JJ,Wang H,Fang XL,et al.Learning and memory function of rats after heat stroke[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(3):272-275.

熱射病(heat stroke,HS)是一種最為嚴重的中暑類型，主要臨床表現為核心體溫(core temperature,Tc)增高達40℃以上，同時并發中樞神經系統異常，如注意力不集中、記憶減退、共濟失調、譫妄、驚厥、昏迷等，重癥患者可出現多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)，其中認知及小腦功能損害最為突出[1-2]。本研究建立熱射病大鼠模型，應用Morris水迷宮檢測小鼠的學習記憶能力。

1 材料和方法

1.1 試驗動物及分組

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠60只，中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，清潔級，體重280～300 g，實驗動物質量合格證號：SCXK-(軍)2012-0004。5只一籠飼養，室溫(25± 0.5)℃，12 h晝/夜周期，自由取食和飲水。適應環境4 d。試驗前應用Morris水迷宮測試剔除先天愚鈍的大鼠。

大鼠按體重大小編號1～60，使用隨機數字表分為正常對照組(n=8)、手術對照組(n=8)和模型組(n=44)。

1.2 試驗儀器

PowerLab/4SP多通道生理記錄儀：澳大利亞ADInstruments公司。XMZ404電子溫度傳感器、動脈壓力傳感器、Morris水迷宮跟蹤系統：北京眾實迪創科技發展有限責任公司。

1.3 造模方法

3%戊巴比妥鈉1 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠。

正常對照組大鼠置于(22±0.5)℃，濕度25%的環境中，不做任何處理；蘇醒后飼養在(25±0.5)℃的飼養房內，12 h晝/夜周期，自由取食和飲水。

手術對照組大鼠行股動脈插管，監測心電及動脈壓，置于(22±0.5)℃，濕度25%的環境中，維持核心體溫(34±1)℃。蘇醒后放入單獨籠中，飼養在(25± 0.5)℃飼養房內，12 h晝/夜周期，自由取食和飲水。

模型組行股動脈插管，監測心電、動脈壓及直腸溫度，置于溫、濕度控制箱中，熱暴露條件為(39.5± 0.2)℃，濕度13.5%，加熱燈光開關時間比為15 s/30 s，發生熱射病(熱應激后約120～150 min，大鼠核心體溫＞42℃或平均動脈壓降至50 mmHg左右)后迅速予4℃涼水沖洗10 min。蘇醒后放入單獨籠中，飼養在(25±0.5)℃的飼養房內，12 h晝/夜周期，自由取食和飲水。

1.4 一般狀態觀察

造模后密切觀察各組大鼠死亡情況、精神狀態、進食狀況、活動步態狀況及抽搐等。

1.5 Morris水迷宮測試

造模7 d后行Morris水迷宮測試。

1.5.1 定位航行試驗(place navigation)

實驗前1 d，將大鼠放入水池中(不放平臺)自由游泳2 min，使其熟悉迷宮環境。實驗開始后，每天訓練4次，訓練時間為每天9:00～17:00。從池壁4個起始點的任一點將小鼠面向池壁放入水池，錄像記錄系統記錄大鼠找到平臺的時間(逃避潛伏期)和游泳路徑。如果大鼠在120 s內找不到平臺，則由實驗者將其引至平臺，在平臺上休息10 s，潛伏期記為120 s。每次訓練間隔至少1 h。每天4次訓練潛伏期的平均值作為大鼠當日的學習成績。

1.5.2 空間探索試驗(spatial probe)

第6天撤除平臺，將大鼠任選1個入水點放入水中，所有大鼠為同一入水點，記錄大鼠120 s內跨越原平臺的次數及在目標象限停留時間。

1.6 統計學分析

應用SPSS 19.0統計軟件進行分析。服從或近似正態分布的計量資料以(±s)表示，采用單因素方差分析，用Levene法進行方差齊性檢驗，若方差齊，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，若方差不齊則采用組間兩兩比較Games-Howell方法。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 一般狀態

44只模型組大鼠在(152.370±24.21)min發生熱射病，即刻平均動脈壓迅速下降，幾乎所有大鼠在核心體溫達40℃以上，鼻中流出大量水樣分泌物。大多數大鼠在發生熱射病時均有抽搐。2只在發生熱射病后不久腹瀉，隨后死亡。共死亡16只，均發生在造模后24 h內，成活率53.6%。

模型組大鼠蘇醒后出現飲食減少、倦怠少動、精神萎靡、毛發混亂、嗜睡、反應遲鈍、行動緩慢、步態不穩等癥狀，7 d后癥狀好轉，反應較正常組對照組及手術對照組稍慢、較溫順。正常組及手術對照組大鼠未見明顯行為學異常。

2.2 Morris水迷宮測試

初篩試驗第5天測試結果用0 d表示。造模結束7 d后再次水迷宮定位航行實驗5 d，記為1～5 d。0～3 d時，三組定位航行逃避潛伏期無顯著性差異(P＞0.05)；4～5 d時，模型組逃避潛伏期較正常對照組和手術對照組延長(P＜0.05)，正常對照組和手術對照組之間無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

空間探索試驗模型組目標象限停留時間及經過平臺次數較正常對照組和手術對照組減少(P＜0.05)。見表2。

表1 各組治療前后Morris水迷宮測試逃避潛伏期比較(s)

表2 各組大鼠Morris水迷宮測試空間探索比較

3 討論

中暑是在高溫天氣、濕度大、無風環境下出現的體溫調節中樞功能障礙，以無汗、水電解質過多喪失為特征的疾病[3]。中暑的嚴重階段即稱之為熱射病[4]。熱射病是由于過高的溫度造成的急性機體損傷，可導致個體死亡，且死亡率特別高。

高熱可導致中樞神經系統損害，依據神經系統癥狀發生的時間順序，可分為3個階段：急性期、恢復期以及永久性損害。急性期主要表現為精神異常、抽搐及意識障礙[5]；恢復期主要表現為短暫的神經功能不全，包括注意力不集中、記憶減退、意識錯亂、躁動、攻擊性、視覺受損、行為不當、定向力障礙及小腦體征等癥狀[6]；而永久性損害最主要的表現是認知損傷與小腦體征[7-8]。文獻報道，20%～30%熱射病幸存者遺留永久性中樞神經系統損害[9]。熱射病后出現精神和認知方面的改變的發病機制目前仍不明了。已有大量文獻報道，熱射病后存在一過性或長期認知功能后遺癥狀，輕者表現為記憶力下降、注意力不集中，重者表現為全面癡呆[10-11]。

根據動物熱射病診斷標準與國外相關文獻，當高溫應激動物核心溫度達到42.0℃以上，或動脈收縮壓上升到達峰值后下降到50 mmHg時，為發生重度熱射病的標志[12]。本研究以平均動脈壓從峰值下降到50 mmHg左右為標準建立大鼠熱射病模型，輔以監測大鼠肛溫。造模成功大鼠行為觀察符合熱射病表現，正常組及假手術組大鼠未見明顯行為學異常。

Morris水迷宮測試是用于嚙齒類動物學習記憶功能力評估的重要工具，由英國生理學Richard G.Morris設計并首次使用，最常采用的實驗動物是大鼠與小鼠[13]。定位航行實驗又叫隱匿平臺實驗，受試動物在多次的訓練中，學會尋找固定位置的隱蔽平臺，以異我為參照點，形成穩定的空間位置認知，所形成的記憶是一種空間參考記憶，用于動物空間學習能力的檢測；空間探索實驗評價動物空間記憶能力[14]。

本研究顯示，造模前各組大鼠學習記憶能力差別不大。造模7 d后，模型大鼠空間學習記憶能力受損。

熱射病常見的受損的部位包括大腦皮層、海馬、邊緣系統、小腦、腦干、脊髓等[15]。McLaughlin等發現，熱射病患者MRI檢查示雙側內囊、殼核和小腦均有疑似出血灶，指出這些細小靜脈血栓常出現在亞急性期，是遲緩性腦萎縮的前驅表現[16]。Mahajan等報道1例非洲裔54歲男性熱射病患者，入院后9 d MRI檢查顯示雙側海馬區、皮質下白質異常，雙側小腦及尾狀核均勻增強[17]。前期我們對熱射病大鼠中樞神經系統損害的試驗研究發現，熱射病對海馬及小腦造成一定病理損害。

高熱導致大鼠海馬區及小腦神經元細胞凋亡、壞死，細胞數目減少，細胞內尼氏體減少或消失，細胞形態皺縮，嚴重者還出現海馬及小腦的缺血壞死，這些改變主要位于海馬CA3、CA4、CA1區域[18]。Lee等發現，熱射病后小腦損傷及癥狀的產生可能由于小腦Purkinje細胞對熱損傷尤其敏感，Purkinje細胞嚴重丟失[15]。Fushimi等也證實小腦傳出通路通常受損[19]。

熱射病后腦損害機制有多種學說，其中腦缺血、缺氧是熱射病后腦損傷的主要病理生理基礎。有文獻報道，動物實驗發現，短暫的腦缺血可導致對缺血特別敏感的神經元受損，缺血后2～4 d可出現廣泛的神經元壞死和脫失；易損的神經元主要分布在海馬、紋狀體和大腦皮質[20-21]。

海馬是參與學習記憶功能最重要的腦區之一，由相互聯系的CA1、CA3和齒狀回等多個區域組成。海馬的損傷可導致學習記憶能力下降。近年來，隨著影像學、神經電生理學、解剖學、分子生物學等學科的發展，證實小腦也參與了非運動的高級認知功能，小腦某些區域損害，可引起高級認知功能障礙，如記憶力減退、注意力不集中、推理能力減退、語言障礙等[22]。已經證實熱射病后有小腦損害，推測小腦損傷可能也參與熱射病后認知功能損害，有待進一步研究。

熱射病在軍隊中更常見，特別是在高溫下訓練作戰的戰士。由于這種熱損傷都是急性發作，受損傷者通常只需要休息一段時間，又返回訓練。過去對熱射病的研究缺少大量的隨訪和對認知功能的評定，可能忽略了許多認知方面的改變。本研究提示，應該高度重視及隨訪熱射病患者的認知功能。

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Learning and Memory Function of Rats after Heat Stroke

ZHANG Jin-jin1,WANG Heng1,FANG Xiao-li2,ZHOU Li-dong3,WU Shi-wen1
1.The Clinical College of the General Hospital of Chinese People's Armed Police Forces,Anhui Medical University,Beijing 100039,China;2.Xuzhou Medical College,Xuzhou,Jiangsu 221000,China;3.Medical Experimental Center of the General Hospital of Chinese People'sArmed Police Forces,Beijing 100039,China

Objective To observe the learning and memory function of rats after heat stroke.Methods 60 Sprague-Dawley rats were divided randomly into heat stroke group(n=44),sham group(n=8)and control group(n=8).They were tested with the Morris Water Maze 7 days after modeling.The escaping latency was recorded in the first 5 days,and it was recorded with frequency crossing the platform area and the duration in the target quadrant after ridding the platform on the 6th day.Results 16 rats died in the heat stroke group after modeling. The escaping latency increased(P＜0.05),and the cumulative duration in the target quadrant and the frequency of crossing the previous platform decreased(P＜0.05)in the heat stroke group compared with the other groups.Conclusion The learning and memory ability is impaired after heat stroke in rats.

heat stroke;Morris Water Maze;learning and memory;cognitive function;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.03.007

R594.1

A

1006-9771(2015)03-0272-04

2014-11-26

2015-01-06)

國家發改委衛星專項基金項目(No.發改辦高技[2013]2140)。

1.安徽醫科大學武警總醫院臨床學院，北京市100039；2.徐州醫學院，江蘇徐州市221000；3.武警總醫院醫學實驗中心，北京市100039。作者簡介：張進進(1989-)，女，漢族，安徽合肥市人，碩士研究生，主要研究方向：熱射病中樞神經系統的損傷研究。通訊作者：吳士文，男，博士，副教授、碩士研究生導師。E-mail:nuerowu@gmail.com。