刺血療法對急性痛風性關節炎大鼠局部抗炎因子的影響①

呂凱露，夏有兵,，程潔，穆艷云，朱冰梅，羅璽，梁莎，莊克清

刺血療法對急性痛風性關節炎大鼠局部抗炎因子的影響①

呂凱露1，夏有兵1,2，程潔1，穆艷云1，朱冰梅1，羅璽2，梁莎3，莊克清1

目的探討刺血療法治療急性痛風性關節炎的相關抗炎分子機制。方法60只Sprague-Dawley大鼠等分為正常組、正常刺血組、假手術組、模型組、刺血組、藥物組。右踝關節腔注射尿酸鈉建立急性痛風性關節炎大鼠模型。藥物組以布洛芬灌胃治療，正常刺血組和刺血組在右側昆侖穴點刺放血。治療前后測量各組大鼠踝關節周徑。用RT-PCR法和Western blotting法檢測大鼠踝關節白細胞介素(IL)-10、IL-4 mRNA和蛋白表達。結果治療后刺血組較正常組踝關節周徑增大(P＜0.05)，較模型組、藥物組周徑減小(P＜0.05)。刺血組較正常組、模型組、藥物組踝關節IL-10 mRNA的相對表達量升高(P＜0.05)，較正常組、模型組IL-10蛋白表達增加(P＜0.05)；刺血組踝關節IL-4 mRNA和蛋白表達較正常組有升高趨勢，但無顯著性差異(P＞0.05)。結論刺血療法通過促進局部IL-10表達發揮抗炎作用，可能是其治療急性痛風性關節炎的作用機制之一。

急性痛風性關節炎；刺血療法；白細胞介素-10；白細胞介素-4；炎癥

[本文著錄格式]呂凱露，夏有兵，程潔，等.刺血療法對急性痛風性關節炎大鼠局部抗炎因子的影響[J].中國康復理論與實踐,2015,21(3):276-279.

CITED AS:Lü KL,Xia YB,Cheng J,et al.Effects of pricking bloodletting therapy on local anti-inflammatory cytokine in rats with acute gouty arthritis on ankle[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(3):276-279.

痛風性關節炎是一種由關節內尿酸結晶介導的炎癥性關節炎，多與高尿酸血癥有關，易反復發作，若得不到有效治療，極易致殘、致畸，影響關節功能[1-2]。現有治療皆有不同程度的副反應[3-4]。近年臨床報道，刺血療法治療急性痛風性關節炎起效快、療效佳、副作用少[5-8]。我們以往實驗研究結果也證實，刺

血療法能有效快速地減輕關節腔尿酸鈉的沉積，減少炎細胞的浸潤，改善關節軟骨的超微結構，改善局部癥狀及功能活動[9]。有研究表明，急性痛風性關節炎的發生與其局部促炎和抗炎細胞因子的失衡有關[10]。本研究運用刺血療法治療急性痛風性關節炎大鼠[11]，觀察關節內抗炎因子白介素10(interleukin-10, IL-10)、白介素4(interleukin-4,IL-4)的mRNA和蛋白表達變化，探討刺血療法治療急性痛風性關節炎的相關抗炎分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康SPF級Sprague-Dawley大鼠60只，雄性，體重(200±20)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號SCXK(京)2012-0001。每籠5只合籠飼養于南京中醫藥大學SPF級實驗動物中心，室溫22～25℃，12/12 h晝夜節律，自由進食與飲水，適應性飼養1周。將大鼠編號，用隨機數字表法分為正常組(N組)、正常刺血組(BN組)、假手術組(S組)、模型組(UA組)、刺血組(B組)、藥物組(I組)，每組10只。實驗過程中對動物的處置遵循相關動物倫理學要求。

1.2 主要試劑及儀器

尿酸鈉：SIGMA公司。布洛芬混懸液：江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。IL-10抗體、IL-4抗體、β-actin抗體：ABCAM公司。HRP標記的羊抗兔二抗：CST公司。化學發光底物、SYBR Green：THERMO公司。Trizol試劑：INVITROGEN公司。第一鏈cDNA合成試劑盒：ROCHE公司。IL-10基因引物、IL-4基因引物、GAPDH基因引物：上海捷瑞生物工程有限公司。

MIKRO220/220R低溫高速離心機：HETTICH公司。紫外分光光度儀：JENWAY公司。垂直電泳儀，垂直、轉印電泳槽：BIO-RAD公司。化學發光成像儀：上海BIOSHINE公司。Nano微量分光光度計、分子雜交PCR儀：THERMO公司。Mx3000P實時熒光定量PCR儀：STRATAGENE公司。

1.3 造模方法

稱取尿酸鈉0.2 g，充分研磨，加入無菌生理鹽水4 ml，制成5%尿酸鈉混懸液備用。大鼠10%水合氯醛0.35 ml/100 g腹腔注射麻醉。N組、BN組不手術；UA組、B組、I組大鼠將右后肢踝關節擺放成直角，充分暴露踝關節與脛腓骨之間的間隙，75%酒精局部皮膚消毒，4號針頭以45°角從該間隙插入右后肢背側正中踝關節與脛腓骨之間的關節腔，注入5%尿酸鈉溶液50 μl。大鼠右后肢踝關節腫脹，關節活動受限，提示造模成功。S組注入生理鹽水50 μl。

1.4 干預方法

B組于造模后6 h、24 h固定患肢，在右側昆侖穴(后肢外踝與跟腱之間的凹陷中)[12]用0.7 mm注射器針頭點刺放血，深度約0.3 cm，以污血放盡為度；BN組以與B組相同的方式點刺放血，以自然停止出血為度；N組于麻醉后6 h、24 h固定右后肢5 min；S組、UA組分別于造模后6 h、24 h固定患肢5 min；I組于造模后6 h、24 h予布洛芬120 mg/kg灌胃。

1.5 標本采集

造模后48 h，頸椎脫臼法處死大鼠，迅速打開大鼠右后肢脛跗關節，以眼科剪剪切軟骨及周圍肌肉組織，10%PBS快速洗滌，凍存于1.5 ml凍存管內，保存于-80℃冰箱備用。

1.6 檢測方法

1.6.1 踝關節周徑測量

各組在造模后6 h(治療前)、48 h(治療后)分別用長2～3 mm的紙條測量造模踝關節周徑，每個時間點重復測量3次，取平均值[13]。

1.6.2 踝關節IL-10、IL-4 mRNA表達

組織用液氮磨碎后，Trizol試劑提取總RNA，氯仿和異丙醇抽提。微量分光光度計和瓊脂糖電泳鑒定RNA濃度和純度，根據逆轉錄試劑盒說明反轉錄合成cDNA，-20℃凍存備用。取cDNA 2 μl行PCR擴增反應，以GAPDH作為內參。反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s。循環40次。用自帶軟件系統得出相對應的Ct值，計算每個樣本的△Ct，以及樣本的△Ct值和樣本所在組的△Ct均值之差(△△Ct)，△△Ct進行乘冪運算得到Fold change值作為目的基因的mRNA相對表達量。具體序列及擴增長度如下。

IL-10：上游CCT CTG GAT ACA GCT GCG AC；下游AGTAGATGC CGG GTG GTT CA；長201 bp。

IL-4：上游CTT GCT GTC ACC CTG TTC TGC TT；下游TTC TCC GTG GTG TTC CTT GTT G；長176 bp。

GAPDH：上游GGC ACA GTC AAG GCT GAG AAT G；下游ATG GTG GTG AAG ACG CCA GTA；長143 bp。

1.6.3 踝關節IL-10、IL-4蛋白表達

組織用液氮磨碎，加入裂解液勻漿，低溫高速離心機4℃、10000 r/min離心5 min，上清液為總蛋白提取物。用BCA法測定蛋白濃度。將每份蛋白定量為30 μg，上樣20 μl，70/130 V電泳約2 h，轉膜液中以300 mA 2 h電轉移至PVDF膜上；取下PVDF膜，PBST洗膜，置5%BSA中室溫封閉1.5 h；選擇相應的大小范圍的條帶加一抗(1∶3000)中，4℃搖床過夜；PBST洗膜后加二抗(1∶6000)，室溫搖床緩慢搖動2 h；PBST洗膜，化學發光底物發光，化學發光成像系統采集圖像，相應軟件分析系統測定目的蛋白和內參蛋白條帶灰度值，以目的蛋白灰度值/內參灰度值的比值作為該蛋白表達水平。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 踝關節周徑

和N組比較，S組和BN組踝關節周徑未見增大(P＞0.05)。而治療前后UA組、B組、I組踝關節周徑均增大(P＜0.05)。和UA組比較，治療后B組、I組踝關節周徑減少(P＜0.05)，且B組小于I組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組踝關節周徑的比較(mm)

2.2 踝關節IL-10、IL-4 mRNA表達

B組IL-10 mRNA相對表達量較N組、UA組、I組升高(P＜0.05)。各組踝關節IL-4 mRNA相對表達量無顯著性差異(P＞0.05)，但兩兩比較時，UA組踝關節IL-4 mRNA相對表達量較N組、BN組、I組升高(P＜0.05)。見表2。

2.3 踝關節IL-10、IL-4蛋白表達

N組、BN組和S組踝關節IL-10、IL-4蛋白表達無顯著性差異(P＞0.05)。UA組、B組、I組踝關節IL-10蛋白升高(P＜0.05)，B組高于UA組(P＜0.05)。UA組、I組踝關節IL-4蛋白表達較N組升高(P＜0.05)，UA組還較BN組、S組升高(P＜0.05)。見表3。

表2 各組踝關節IL-10、IL-4 mRNA表達比較(2△△Ct)

表3 各組踝關節IL-10、IL-4蛋白表達比較

3 討論

急性痛風性關節炎是尿酸鈉沉積后引起的關節軟骨破壞、滑膜產生炎癥反應，表現為關節紅腫熱痛[14]。中醫認為，急性痛風性關節炎的發病關鍵是血中瘀熱。刺血療法遵循“血有余，則瀉其盛經出其血”的原則，具有清熱、止痛、消腫、祛瘀的治療作用。

IL-10作為一種抗炎細胞因子，主要生理功能為抑制中性粒細胞[15]。Murakami等認為，IL-10過表達可能會對尿酸鈉結晶誘導的急性炎癥起抗炎效果[16]。IL-10主要通過抑制炎性細胞因子、趨化因子和花生四烯酸代謝產物的產生，發揮抗炎作用。Verhoef等認為，IL-10可促使Th1細胞轉化為Th2細胞，亦可提高Ⅰ型膠原蛋白的合成水平，對關節軟骨有保護和修復

作用[17]。

本研究顯示，刺血治療后，急性痛風性關節炎大鼠局部關節IL-10的mRNA和蛋白表達量明顯高于正常組和模型組，發揮抗炎作用。

IL-4是由Th2細胞和肥大細胞分泌的抗炎因子，能抑制IL-1、IL-6、IL-8等炎性細胞因子合成，并能在mRNA水平上阻斷單核細胞、CD4+或CD8+T細胞[18]。本研究顯示，刺血組踝關節IL-4雖有升高的趨勢，但無顯著性。文獻報道，在其他關節炎治療中，IL-4局部抗炎作用的發揮多需治療5 d或以上[19-21]。我們推測B組IL-4表達不高與作用時間不足(48 h)有關。有待進一步研究。

我們以往研究證實，刺血療法清熱、祛瘀、消腫、止痛的作用適用于急性炎癥反應。本研究顯示，刺血療法的清熱、祛瘀、消腫、止痛作用可能是通過上調抗炎因子IL-10的表達實現的。

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Effects of Pricking Bloodletting Therapy on Local Anti-inflammatory Cytokine in Rats with Acute Gouty Arthritis onAnkle

Lü Kai-lu1,XIA You-bing1,2,CHENG Jie1,MU Yan-yun1,ZHU Bing-mei1,LUO Xi2,LIANG Sha3,ZHUANG Ke-qing1
1.Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing,Jiangsu 210023,China;2.Nanjing Medical University,Nanjing,Jiangsu 210029,China;3.Hunan University of Medicine,Huaihua,Hunan 418000

Objective To explore the anti-inflammatory of pricking blood therapy in acute gouty arthritis rats.Methods 60 Sprague-Dawley rats were equally divided into normal group,bloodletting normal group,sham group,arthritis group,bloodletting group and ibuprofen group.The acute gouty arthritis model was established with injecting uric acid sodium salt into the right ankle joint cavity. The ibuprofen group was administrated with ibuprofen intragastrically,the bloodletting normal group and bloodletting group were pricked the right Kunlun(BL60)acupoint.The cross section diameter of the right ankle joint were measured before and after treatment.Levels of mRNA and protein of interleukin(IL)-10 and IL-4 expressed in ankle were determined with RT-PCR and Western blotting Results The cross section diameter increased in the bloodletting group compared with the normal group after treatment(P＜0.05),and decreased(P＜0.05)compared with the arthritis group and the ibuprofen group,while the expression of IL-10 mRNA increased(P＜0.05)compared with the normal group,the arthritis group and the ibuprofen group,as well as the IL-10 protein compared with the normal group and the arthritis group(P＜0.05).The expression of IL-4 mRNA and protein increased without significance(P＞0.05)in the bloodletting group compared with the normal group.Conclusion IL-10 may play a role of anti-inflammatory in pricking bloodletting therapy for acute gouty arthritis.

acute gouty arthritis;pricking bloodletting therapy;interleukin-10;interleukin-4;inflammatory

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.03.008

R589.7

A

1006-9771(2015)03-0276-04

2014-12-16

2015-02-05)

國家自然科學基金資助項目(No.81273840)。

1.南京中醫藥大學，江蘇南京市210023；2.南京醫科大學，江蘇南京市210029；3.湖南醫藥學院，湖南懷化市418000。作者簡介：呂凱露(1991-)，女，漢族，浙江永康市人，碩士研究生，主要研究方向：針灸流派研究、刺血療法的機制研究。通訊作者：夏有兵。E-mail: xyb@njmu.edu.cn。