超高效液相色譜三重四極桿質譜聯用法測定蜂蜜中5種四環素類抗生素的探討

劉兆峰鐘啟升

·論著·

超高效液相色譜三重四極桿質譜聯用法測定蜂蜜中5種四環素類抗生素的探討

劉兆峰1★鐘啟升2

目的建立一種超高效液相色譜儀和三重四極桿質譜儀聯用測定蜂蜜中5種四環素類抗生素殘留的方法。方法通過固相萃取富集樣品中的四環素類抗生素后，使用超高效液相色譜快速分離，三重四極桿質譜儀進行定量分析。結果超高效液相色譜三重四級桿質譜聯用法能定量檢出蜂蜜中5種四環素類抗生素的殘留，對5μg／L、10μg／L和50μg／L混合標準溶液的相對標準偏差在0.62％～3.79％之間，其檢出限為31.9ng／L～63.4 ng／L，定量限為127 ng／L～254 ng／L，樣品加標回收率在86.9％～98.1％之間。結論本法快速、準確、靈敏度高，能滿足蜂蜜中5種四環素類抗生素殘留的檢測。

超高效液相色譜－三重四極桿質譜；四環素類抗生素；蜂蜜

四環素類抗生素（tetracyclines，TCs）包括金霉素（chlotetracycline）、土霉素（oxytetracycline）、四環素（tetracycline）、強力霉素（doxycycline）、去甲基金霉素（demeclocycline hydrochloride）等，是臨床上廣泛應用的廣譜抗生素。然而，不合理地使用該類藥物，如用藥劑量過大、用藥時間過長、濫用藥物及不遵守休藥期提前屠宰等，會導致該類藥物及其代謝產物殘留于動物的肌肉、蛋、奶、臟器組織及分泌物中。四環素類抗生素并不能被動物完全吸收，有相當部分以原形或代謝物形式進入食物鏈和環境中，直接或間接對人體健康造成影響［1］。

近年來，蜂蜜產業發展迅速。我國蜜蜂大多是從國外引進的意蜂，發病率比較高，雖然國家提倡生物防治，但還是有一部分人用化學藥物、抗生素來給蜜蜂預防和治療疾病，導致蜂蜜中抗生素含量較高［2-3］。因此，迫切需要建立蜂蜜中高效靈敏的抗生素檢測方法。

高效液相色譜－串聯質譜聯用技術，特別是三重四級桿質譜儀可以進行母離子掃描、子離子掃描和中性丟失掃描，由于可以有效排除基質離子產生的非目標碎片離子的干擾，優化質譜檢測信號，有效的防止了假陽性的檢出，具有高的選擇性和靈敏度，對復雜基體中的藥物殘留具有準確的定性能力，是近些年來發展很快的分析技術［4-6］。本文建立了一種使用島津超高效液相色譜儀LC-30A和三重四極桿質譜儀LCMS-8040聯用測定蜂蜜中的5種四環素類抗生素的方法，以給分析檢測人員提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

本實驗使用超高效液相色譜儀LC-30A與三重四極桿質譜儀LCMS-8040聯用系統（島津，日本）。具體配置為輸液泵LC-30AD×2，在線脫氣機DGU-20A5，自動進樣器SIL-30AC，柱溫箱CTO-30AC，系統控制器CBM-20A，三重四極桿質譜儀LCMS-8040，色譜工作站為LabSolutions Ver.5.53。

1.2 分析條件

液相條件：使用Shim-pack XR-ODS II（2.0mm I.D.×100mm L.，2.2μm粒徑）色譜柱；流動相A為0.1％甲酸的水溶液，流動相B為甲醇；流速為0.25 m L／min；柱溫為室溫；進樣量為20μL；洗脫方式為梯度洗脫，B相初始濃度為20％，洗脫程序見表1。

質譜條件：離子化模式為電噴霧離子源（正離子）；離子噴霧電壓為4.5 kV；霧化氣為3.0 L／m in流速氮氣；干燥氣為15 L／m in流速的氮氣；碰撞氣為氬氣；去溶劑管溫度為250℃；加熱模塊溫度為400℃；掃描模式為多反應監測（multiple reacting monitoring，MRM），化合物信息和MRM優化參數見表2；駐留時間為10ms；延遲時間為3ms。

1.3 樣品制備

標準溶液配制：稱取適量5種標準物質，分別為四環素、土霉素、去甲基金霉素、金霉素和強力霉素，用甲醇配制1 000mg／L的混合標準儲備液，用甲醇＋0.1甲酸水溶液（V／V，1∶4）稀釋成不同濃度的混合標準工作液。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Program of gradientelution

蜂蜜：市售蜂蜜。

樣品前處理方法：蜂蜜樣品的制備、凈化、提取參照《GB／T 23409-2009蜂王漿中土霉素、四環素、金霉素、強力霉素殘留量的測定液相色譜-質譜／質譜法》［7］。

1.4 加標回收率計算

加標回收率按以下公式計算：加標回收率＝（加標樣品檢出濃度－樣品基質中檢出濃度）／加標濃度×100％。

2 結果

2.1 標準樣品一級質譜圖和產物離子掃描質譜圖

對5種四環素標準樣品進行一級質譜圖和產物離子掃描。由結果顯示，5種四環素均能得到加氫峰，其產物離子碎片均較為豐富。四環素的一級質譜圖見圖1，產物離子掃描質譜圖見圖2。土霉素的一級質譜圖見圖3，產物離子掃描質譜圖見圖4。去甲基金霉素的一級質譜圖見圖5，產物離子掃描質譜圖見圖6。金霉素的一級質譜圖見圖7，產物離子掃描質譜圖見圖8。強力霉素的一級質譜圖見圖9，產物離子掃描質譜圖見圖10。

2.2 標準樣品的MRM色譜圖

圖11為100μg／L 5種四環素標準樣品在最優色譜條件下得到的MRM色譜圖。5種四環素峰型對稱、尖銳，分離度良好，基線較為平穩。

2.3 線性范圍

將0.2μg／L、0.5μg／L、1μg／L、2.5μg／L、5 μg／L、10μg／L、50μg／L、100μg／L和200μg／L不同濃度的混合標準工作液按1.2中的分析條件進行測定，外標法定量。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制校準曲線；所得校準曲線線性關系良好，線性方程及相關系數見表3。

表2 化合物信息和MRM優化參數Table 2 Compound informations and MRM optimal parameters

圖1 四環素的一級質譜圖Figure 1 Firstordermass spectrum of tetracycline

圖2 四環素的產物離子掃描圖（CE值-20V）Figure 2 Ion scanning graph of tetracycline products（CE-20V）

圖3 土霉素的一級質譜圖Figure 3 Firstordermass spectrum of oxytetracycline

圖4 土霉素的產物離子掃描圖（CE值-19V）Figure 4 Ion scanning graph of oxytetracycline products（CE-19V）

圖5去甲基金霉素的一級質譜圖Figure 5 Firstordermass spectrum of ledermycin

圖7 金霉素的一級質譜圖Figure 7 First ordermass spectrum of chlortetracycline

圖8 金霉素的產物離子掃描圖（CE值-22V）Figure 8 Ion scanning graph of chlortetracycline products（CE-22V）

圖9 強力霉素的一級質譜圖Figure 9 Firstordermass spectrum of doxycycline

圖10 強力霉素的產物離子掃描圖（CE值-19V）Figure 10 Ion scanning graph of doxycycline products（CE-19V）

2.4 精密度實驗

對不同濃度混合標準工作液連續測定6次，考察儀器的精密度，保留時間和峰面積的重復性結果如表4所示。結果顯示：不同濃度標準品保留時間和峰面積的相對標準偏差分別在0.20％～1.34％和0.62％～3.79％之間，儀器精密度良好。

1.四環素；2.土霉素；3.去甲基金霉素；4.金霉素；5.強力霉素

圖12 無加標蜂蜜樣品樣的MRM色譜圖（檢出1為四環素）Figure 12 MRM chromatography of non-spiked honey sample（detected 1：tetracycline）

圖13 蜂蜜加標（2μg／kg）樣品的MRM色譜圖Figure 13 MRM chromatography of honey sample adding standard solution（2μg／kg）

表3 校準曲線參數Table 3 Parameters of calibration curve

表4 保留時間和峰面積重復性結果（n＝6）Table 4 The repeatability results of retention time and peak area（n＝6）

表5 四環素類抗生素的檢出限和定量限Table 5 The lim its of detection and lim its of quantitation of tetracycline

2.5 檢出限

配制濃度為為200 ng／L標樣7份，直接進樣分析，將平行7次測定結果計算標準偏差S，此時檢出限MDL＝3.14×S，定量下限LOQ＝4×MDL。測定結果如表5所示。

2.6 回收率實驗

以蜂蜜為待測樣品，檢測5種四環素類抗生素。在2 g蜂蜜樣品中檢出四環素，濃度為0.249 μg／kg，色譜圖（圖12）峰型平滑、尖銳，其他3種四環素類抗生素沒有標準峰型出現。為了研究該分析方法對蜂蜜樣品中四環素類抗生素的實際檢測效果，向蜂蜜樣品中加入濃度為2μg／kg的5種四環素類抗生素標準物質，加標色譜圖（圖13）5種四環素類抗生素均出現平滑尖銳峰型經加標回收率（表6）計算，其平均回收率分別為四環素98.1％、土霉素95.2％、去甲基金霉素86.9％、金霉素88.3％、強力霉素為98.1％。

3 討論

目前，液相質譜聯用技術已廣泛用于微生物、蛋白質組學、化學生物學等學科，在探究新的機理、新的化合物方面發揮著越來越重要的作用［8－11］。同時，在藥物和食品殘留分析方面，與蜂蜜中四環素族檢測傳統標準方法［12］相比，液相質譜聯用技術檢測速度更快、定量更準確、分析四環素類化合物的具體種類更精確，指導食品行業發展更有指向性，提供給執法部門的數據更明確，大大提高了相關部門的效率。以四環素、土霉素、強力霉素和金霉素與前處理方法相同的GB／T 23409－2009［7］相比，其加標回收率土霉素（95.2％）比85.2％～120.8％的回收率提高10％左右，四環素（98.1％）比73.5％～115.4％的回收率提高20％左右，強力霉素（98.1％）比65.8％～115.2％的回收率提高20％左右，

金霉素的加標回收率也有所提高。

使用島津超高效液相色譜儀LC-30A和三重四極桿質譜儀LCMS-8040聯用測定蜂蜜樣品中的四環素類抗生素MRM色譜圖峰型對稱、尖銳，分離度良好，基線較為平穩，同時校準曲線的相關系數都在0.999 6以上，說明該檢測方法和前處理方法適合檢測蜂蜜中四環素類抗生素殘留，可以進一步研究穩定條件，提高檢測精度和準度，使其作為國標或行標被檢測單位所采用。

本文建立了一種使用島津超高效液相色譜儀LC-30A和三重四極桿質譜儀LCMS-8040聯用測定蜂蜜樣品中的四環素類抗生素殘留量的檢測方法，該方法前處理簡單，分析時間快，靈敏度高，精密度良好，且線性范圍寬，相關系數在0.999 6以上，對5μg／L、10μg／L和50μg／L混合標準溶液的相對標準偏差在0.62％～3.79％之間，其檢出限為31.9 ng／L～63.4 ng／L，定量限為127 ng／L～254 ng／L。通過對市售蜂蜜樣品的測定，能夠檢測出微量四環素，對蜜蜂樣品進行加標分析，得到樣品加標回收率在86.9％～98.1％之間，證明該方法適合蜂蜜樣品種衡量四環素的分析檢測。

表6 四環素類抗生素加標回收率結果Table 6 The recoveries results of tetracyclines in honey

[1]賀德春,許振成,吳根義,等.四環素類抗生素的環境行為研究進展[J].動物醫學進展,2011,32(4):98-102.

[2]夏環,王妍,荊濤,等.分子印跡固相萃取-高效液相色譜法測定蜂蜜中三種氟喹諾酮類抗生素殘留[J].分析科學學報,2012,31(3):297-302.

[3]李坤威,張劍,沈克強,等.國內外蜂蜜標準比對分析[J].標準科學,2015,22(4):67-69.

[4]趙紅霞.超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜(UPLC-QqQ-MS/MS)對農作物中農藥多殘留的檢測研究[D].濟南:山東大學化學與化工學院,2013.

[5]QiW,Guan Q,Sun T,et al.Improving detection sensitivity of am ino acids in thyroid tissues by using phthalic acid as a mobile phase additive in hydrophilic interaction chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry[J].Analytica Chim ica Acta,2015,870:75-82.

[6]Matsuda F,Ogura T,Tomita A,et al.Nano-scale liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry using the multiple reaction monitoring mode based quantitative platform for analyzing multiple enzymes associated w ith central metabolic pathways of Saccharomyces cerevisiae using ultra fastmass spectrometry[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering,2015,119(1): 117-120.

[7]GB/T 23409-2009.蜂王漿中土霉素、四環素、金霉素、強力霉素殘留量的測定液相色譜-質譜/質譜法[S]. 2009,1-6.

[8]Son N,Hur HJ,Sung MJ,et al.Liquid chromatographymass spectrometry-based metabolom ic analysis of livers from aged rats[J].Journal of Proteome Research,2012, 11(4):2551-2558.

[9]Erta?A，Bogˇa M，Y?lmaz MA，et al.Chemical compositions by using LC-MS/MS and GC-MS and biological activities of Sedum sediforme(Jacq.)Pau[J].JAgric Food Chem,2014,62(20):4601-4609.

[10]Salm inen JP,Shikov AN,Karonen M,et al.Rapid profiling of phenolic compounds of green and fermented bergenia crassifolia L.leaves by UPLC-DAD-QqQ-MS and HPLC-DAD-ESI-QTOF-MS[J].Nat Prod Res, 2014,28(19):1530-1533.

[11]de Rijke E,Essers ML,Rijk JC,et al.Selective androgen receptormodulators:in vitro and in vivometabolism and analysis[J].Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess,2013,30(9):1517-1526.

[12]GB/T 5009.95-2003.蜂蜜中四環素族抗生素殘留量的測定[S].2003,1-6.

Discussion on determ ination of 5 kinds of tetracyclines residues in honey by ultra-performance liquid chromatography coup led w ith triple quadrupole mass spectrometry

LIU Zhaofeng1★,ZHONG Qisheng2
(1.Guangdong Institute for Food and Drug Control,Guangzhou,Guangdong,China,510180；2.Analytical Center,Guangzhou Branch,Shimadzu(China)Co.,LTD.,Guangzhou,Guangdong,China,510010)

Objective To establish amethod for determ ination of 5 tetracyclines residues in honey by the ultra-performance liquid chromatography coupled w ith triple quadrupolemass spectrometry(UPLC-MS/ MS).Methods A fter concentrated by solid phase extraction,5 tetracyclines in honey were then separated by ultra-performance liquid chromatography and quantified by triple quadrupolemass spectrometry.Results The 5 tetracyclines residues in honey were quantify detected by UPLC-MS/MS.The relative standard deviations of 5 μg/L、10μg/L and 50μg/Lmixed standard solution were in the range of 0.62％～3.79％.The limits of detection and lim its of quantitation were 31.9 ng/L～63.4 ng/L and 127 ng/L～254 ng/L,respectively.The recoveries of three spiked levelswere range from 86.9％～98.1％.Conclusion Themethod of UPLC-MS/MS is rapid,accurate,sensitive and canmeet the requirements for the determination of 5 tetracyclines residues in honey.

Ultra-performance liquid chromatography coupled w ith triple quadrupolemass spectrometry(UPLC-MS/MS)；Tetracyclines；Honey

1.廣東省食品藥品檢驗所，廣東，廣州510180 2.島津企業管理（中國）有限公司廣州分公司分析中心，廣東，廣州510010

★通訊作者：劉兆峰，E-mail：9016117＠qq.com