肝細胞癌患者血清中CD31表達水平及其對腫瘤細胞侵襲及增殖的影響

周煥城，彭廣福，宋越，張彩云，王捷

（1中山大學孫逸仙紀念醫院肝膽外科，廣東 廣州 510000；2.廣東省梅州市人民醫院肝膽外科，廣東 梅州 514000）

·論著·

肝細胞癌患者血清中CD31表達水平及其對腫瘤細胞侵襲及增殖的影響

周煥城1，彭廣福2，宋越2，張彩云2，王捷1

（1中山大學孫逸仙紀念醫院肝膽外科，廣東 廣州 510000；2.廣東省梅州市人民醫院肝膽外科，廣東 梅州 514000）

目的探討肝細胞癌（HCC）患者血清CD31表達水平以及對肝癌細胞侵襲和增殖影響。方法選取該院45例HCC患者為研究組，45例同期體檢的健康人群為對照組，ELISA檢測肝癌患者血清CD31表達水平；采用小分子干擾RNA（siRNA）抑制肝癌細胞中CD31的表達，transwell法觀察CD31對肝癌細胞侵襲的影響，CCK-8（Cell Counting Kit-8）法檢測肝癌細胞增殖的變化。結果CD31在肝癌患者血清中的表達水平顯著高于正常健康人群，差異具有統計學意義（P＜0.05）；抑制肝癌細胞中CD31的表達后，肝癌細胞的侵襲和增殖能力顯著下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結論CD31在肝癌患者血清中高表達，并可增強肝癌細胞的侵襲和增殖能力。

CD31；肝細胞癌；侵襲；增殖

原發性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），簡稱肝癌，是惡性程度最高、最常見的腫瘤之一，具有進展快、治療復雜及生存時間短等特點，目前仍以手術切除為主要治療手段，國外學者研究報道肝癌5年生存率12%左右，而國內學者研究認為肝癌5年生存率約為32.5%[1-2]。目前為止，肝癌的發病機制尚未完全明確，越來越多的研究者關注肝癌細胞內基因表達對肝細胞癌的發生、發展及其轉歸的影響。

CD31又稱為血小板-內皮細胞黏附分子（plateletendothelialcelladhesionmolecule-1，PECAM-1/CD31），最早發現于1990年[3]，分子量約為130 kDa，其結構屬于免疫球蛋白超家族成員，近年來的研究表明CD31與動脈粥樣硬化癥、肺癌及卵巢癌[4-6]等多種疾病的發病機制有關，然而，CD31在肝細胞癌的發病機制中作用的報道尚少。本文旨在研究CD31在肝細胞癌患者血清中的表達，以及干擾肝癌細胞中CD31表達后，對肝癌細胞侵襲及增殖能力的影響，從而對于肝細胞癌的防治提供一定的理論基礎。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年6月-2015年3月，本科室肝癌手術患者45例為研究組。男21例，女24例；年齡39～75歲，平均（51.67±7.37）歲。所有患者術前均未經介入或放化療等治療，均接受了肝癌根治性切除術，所有患者術后病理學證實為肝細胞癌，且未發現遠處轉移，排除合并其他慢性病如高血壓、糖尿病，或其他腫瘤的患者。對照組為同期健康體檢人群45例。其中，男20例，女25例；年齡37～78歲，平均（54.02±7.98）歲。

1.2 主要試劑

SMMC-7721細胞購自ATCC公司，DMEM培養基、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司，熒光標記的2'-O-甲基siRNA CD31-FAM、穩定陰性對照siRNA CD31-NC和CD31引物購自上海吉瑪生物技術有限公司，RNA提取試劑盒Trizol購于Gibco公司，Real-time PCR試劑盒購自Roche公司，抗CD31抗體購自Abcam公司，抗β-actin抗體購自Santa Cruz公司，羊抗兔二抗購自Santa Cruz公司，CCK-8購自上海博谷生物科技有限公司。

1.3 細胞培養

SMMC-7721細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養，細胞生長至對數生長期時，以1×105個/平皿,接種于6 cm平皿，或以4×106個細胞/平皿,接種于10 cm平皿，孵育細胞。

1.4 細胞轉染

采用脂質體2000（美國Invitrogen公司）對人肝癌細胞SMMC-7721中CD31 mRNA抑制表達，于48 h候檢測其干擾效率。CD31 siRNA干擾序列：正向5'-UUCCGUUCUAGAGUAUCUG-3'，反向5'-CAGA UACUCUAGAACGGAA-3'。

1.5 檢測指標

1.5.1 ELISA檢測肝癌患者血清CD31表達水平取研究組和對照組患者外周血2 ml，靜置6 h后，離心取上清，依照產品說明書，ELISA試劑檢測兩組CD31的表達水平。

1.5.2 Real-time PCR檢測肝癌細胞中CD31mRNA表達水平將培養至對數生長期的肝癌細胞，用Trizol提取各組總RNA，反轉錄為cDNA，以作為GAPDH內參，依照產品說明書，測定TNF-α的變化。CD31引物序列正向：TCCAGGCCAGCTGCTCCACTT；反向：GCCTTCCGTTCTCTTGGTGAGGC。

1.5.3 Western blot檢測肝癌細胞中CD31蛋白表達水平肝癌細胞培養至對數生長期，按照蛋白抽提步驟，提取總蛋白；采用BCA法測定總蛋白濃度，經SDS-PAGE電泳后轉移到NC膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，TBST洗滌后，分別加入1∶1 000抗CD31抗體、1∶500抗β-actin抗體，4℃孵育過夜，TBST洗滌后加入1∶5 000辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，37℃孵育1 h，再用TBST洗滌，化學發光并曝光成像。Weastern blot檢測以β-actin條帶作為內參，CD31條帶與其比較，觀察CD31蛋白表達變化。

1.5.4 細胞遷移實驗將處于對數生長期的肝癌細胞，調整細胞密度至4×l05個/ml，按0.1 ml/孔加入到transwell小室的上層，小室下層加入1 ml的含有10%血清的培養液。培養24 h后，對己遷移至小室下層的細胞進行計數（隨機選取5個視野）。

1.5.5 細胞增殖實驗將對數生長期的細胞以50%的匯合率接種至96孔板，每組設置3個復孔，同時設置不含細胞的空白培養基作為對照，37℃，5%二氧化碳CO2，95%濕度下培養24 h后，分別在培養孔加入10μl CCK-8溶液；再置于孵箱孵育2 h，酶標儀檢測450 nm的吸光值，每孔實測OD值需減去空白對照OD值，取3復孔平均值，記錄OD值。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 肝癌患者血清CD31表達水平

與建康人群相比，CD31在肝癌患者血清中的表達水平顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.001），提示CD31的高表達在肝癌的發生發展中可能發揮重要的調節功能（表1）。

附表 肝癌患者血清中CD31的表達水平

2.2 肝癌細胞轉染siRNACD31后CD31表達變化

SMMC-7721肝癌細胞轉染siRNA CD31后，同對照相比，CD31mRNA的表達水平明顯下降（見圖1A），CD31蛋白表達水平也明顯降低（見圖1B），差異均具有統計學意義，提示低表達CD31肝癌細胞構建成功。

圖1 轉染siRNA CD31后肝癌細胞中CD31表達變化

2.3 肝癌細胞中CD31對細胞侵襲功能的影響

SMMC-7721肝癌細胞轉染siRNACD31后，同對照相比，transwell小室下層細胞數量顯著減少（圖2），差異具有統計學意義（P＜0.001），提示了CD31具有增強肝癌細胞侵襲能力。

圖2 肝癌細胞中CD31對細胞侵襲功能的影響

2.4 肝癌細胞中CD31對細胞增殖的影響

SMMC-7721肝癌細胞轉染siRNA CD31后，同對照相比，肝癌細胞增殖顯著減少（圖3），差異具有統計學意義（P＜0.001），提示了CD31具有增強肝癌細胞侵襲能力。

圖3 肝癌細胞中CD31對細胞增殖的影響

3 討論

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內，肝癌的發病率居惡性腫瘤的第5位，病死率居第3位，而且55%的肝癌患者分布于我國[7]。目前，肝癌的發病機制尚未明確，診斷和治療仍是臨床難題之一。近年來，研究學者認為基因調控在肝癌發病機制中起到重要作用，特別是對肝癌細胞的黏附、侵襲和增殖的影響[8]，所以，肝癌細胞特異性的基因調控靶點是肝癌的診斷和治療的全新研究方向。

CD31/PECAM-1是血管內皮細胞特異性標志物，可以通過細胞間、細胞核細胞基質間的相互作用，參與多種信號轉導和炎癥反應。隨著研究的深入，在腫瘤細胞表達CD31，在腫瘤的基因調控中發揮作用[9-10]。本研究檢測肝癌患者血清CD31的表達水平明顯高于正常健康人群，提示高表達CD31可能起到調控肝癌細胞中的信號途徑[11]，從而影響肝癌的發生發展。這與DAROM等人[12]研究發現CD31/ PECAM-1在非何杰金氏胃淋巴瘤患者體內表達增高結果是一致的，從側面支持了本研究。

小分子干擾RNA（small interference RNA，siRNA）正逐漸取代反義核苷酸技術，成為腫瘤基因療法的理想工具[13]。研究表明，陽離子脂質體可有效地實現siRNA的靶向輸送，2'-O-甲基修飾的siRNA可提高siRNA的穩定性[14]。本研究通過siRNA干擾抑制肝癌細胞中CD31的表達，用以研究CD31對肝癌細胞的影響。結果顯示采用siRNA干擾抑制CD31的表達后，檢測肝癌細胞中CD31的基因和蛋白表達水平均顯著低于未受干擾的肝癌細胞，，說明低表達CD31肝癌細胞株構建成功。

腫瘤細胞的侵襲和增殖能力與腫瘤的轉移和生長速度密切相關，影響著腫瘤的發展和轉歸[15-16]。本研究運用已構建成功的低表達CD31肝癌細胞與未受干擾抑制高表達CD31肝癌細胞相比，通過transwell實驗發現高表達CD31肝癌細胞的侵襲能力顯著強于低表達CD31肝癌細胞，說明CD31表達水平的高低影響著肝癌細胞的侵襲能力。此外，本研究運用CCK-8實驗研究肝癌細胞增殖能力發現，高表達CD31肝癌細胞的增殖能力顯著強于低表達CD31的肝癌細胞，說明CD31表達水平越高，肝癌細胞的增殖能力越強。CD31的表達水平影響肝癌細胞的侵襲和增殖能力，這與TACHEZY M等人在導管內乳頭狀黏液性腫瘤中的研究結果是一致的[17]。

綜上所述，在肝癌患者血清中CD31的表達水平顯著升高，而且抑制CD31的表達水平可能減弱肝癌細胞的侵襲和增殖能力，從而使肝癌生長速度減慢，侵襲能力下降，這為肝癌的診斷和治療的新靶點提供了理論參考依據。

[1]EL-SERAG HB.Hepatocellular carcinoma[J].N Engl J Med, 2011,365(12):1118-1127.

[2]GONG K,LI W,SHIKONIN.A Chinese plant-derived naphthoquinone,inducesapoptosisinhepatocellularcarcinomacells through reactive oxygen species:A potential new treatment for hepatocellular carcinoma[J].Free Radic Biol Med,2011,51(12): 2259-2271.

[3]NEWMAN PJ,BERNDTMC,GORSKIJ,etal.PECAM-1 (CD31)cloning and relation to adhesion molecules of the immunoglobulingenesuperfamily[J].Science,1990,247(4947): 1219-1222.

[4]FORNASA G,CLEMENT M,GROYER E,et al.A CD31-derived peptide prevents angiotensin II-induced atherosclerosis progression and aneurysm formation[J].Cardiovasc Res,2012,94(1): 30-37.

[5]ZHAO H,HUANG Y,XUE C,et al.Prognostic significance of the combined score of endothelial expression of nucleolin and CD31 in surgically resected non-small cell lung cancer[J].PLoS ONE,2013,8(1):e54674.

[6]RUBATT JM,DARCY KM,HUTSON A,et al.Independent prognostic relevance of microvessel density in advanced epithelial ovarian cancer and associations between CD31,CD105,p53 status,and angiogenic marker expression:A Gynecologic Oncology Group study[J].Gynecol Oncol,2009,112(3):469-474.

[7]夏冬,吳斌,梁建群,等.包載TIMP-1重組腺病毒微球的制備及其對肝癌細胞增殖的抑制[J].中國腫瘤生物治療雜志,2010,17(1): 57-61.

[8]LU JT,HE W,SONG SS,et al.Paeoniflorin inhibited the tumor invasion and metastasis in human hepatocellular carcinoma cells [J].Bratisl Lek Listy,2014,115(7):427-433.

[9]LEE SH,LEE SJ,JIN SM,et al.Relationships between lymph node metastasis and expression of CD31,D2-40,and vascular endothelial growth factors A and C in papillary thyroid cancer[J]. Clinical and Experimental Otorhinolaryngology,2012,5(3):150-155.

[10]VIRMAN J,BONO P,LUUKKAALA T,et al.VEGFR3 and CD31 as prognostic factors in renal cell cancer[J].Anticancer Res,2015,35(2):921-927.

[11]DELISSER H,LIU Y,DESPREZ PY,et al.Vascular endothelial platelet endothelial cell adhesion molecule 1(PECAM-1) regulates advanced metastatic progression[J].Proc Natl Acad SciUSA,2010,107(43):18616-18621.

[12]DAROM A,GOMATOS IP,LEANDROS E,et al.Molecular markers(PECAM-1,ICAM-3,HLA-DR)determine prognosis in primary non-Hodgkin's gastric lymphoma patients[J].World J Gastroenterol,2006,12(12):1924-1932.

[13]YANGZ,CHENGQ,JIANGQ,etal.Thermo-sensitive nanoparticles for triggered release of siRNA[J].Journal of biomaterials science Polymer edition,2015,26(4):264-276.

[14]ALEKU M,SCHULZ P,KEIL O,et al.Atu027,a liposomal small interfering RNA formulation targeting protein kinase N3, inhibitscancerprogression[J].CancerRes,2008,68(23): 9788-9798.

[15]SAMARZIJA I,BEARD P.Hedgehog pathway regulators influence cervical cancer cell proliferation,survival and migration[J]. Biochem Biophys Res Commun,2012,425(1):64-69.

[16]ZHAO QM,KUANG F,WU H,et al.Attenuation of enoyl coenzyme A hydratase 1 expression in colorectal cancer cells using small interfering RNA inhibits cell proliferation and migration[J].Mol Med Rep,2015,12(1):470-474.

[17]TACHEZY M,REICHELT U,MELENBERG T,et al.Angiogenesis index CD105(endoglin)/CD31(PECAM-1)as a predictive factor for invasion and proliferation in intraductal papillary mucinous neoplasm(IPMN)of the pancreas[J].Histol Histopathol, 2010,25(10):1239-1246.

Expression of CD31 in the serum of hepatocellular carcinoma patients and the effects of cancer cell migration and proliferation

Huan-cheng ZHOU1,Guang-fu PENG2,Yue SONG2,Cai-yun ZHANG2,Jie WANG1
(1.Department of Hepatobiliary Surgery,Sun Yet-sen Memorial Hospital of Zhongshan University, Guangzhou,Guangdong 510000,P.R.China;2.Department of Hepatobiliary Surgery,Meizhou People's Hospital,Meizhou,Guangdong 514000,P.R.China)

【Objective】To investigate the expression of CD31 in the serum of HCC patients and the effects of cancer cell migration and proliferation.【Methods】45 cases of HCC patients in our hospital as the study group,40 healthy volunteers were used as control group,we used ELISA to detect the expression of CD31 in the serum of HCC patients.Using small interfering RNA(siRNA)to inhibit the expression of CD31 in hepatocellular carcinoma,the level of cancer cell migration was observed by transwell and the level of cell proliferation was observed by CCK-8.【Results】the expression of CD31 in the serum of HCC patients was significantly higher than the control group,the difference was statistically significant(P＜0.05);After the expression of CD31 was suppressed in hepatocellular carcinoma,the levels of cancer cell migration and proliferation were significantly decreased,the difference was statistically significant(P＜0.05).【Conclusion】the expression of CD31 in the Serum of HCC patients is increased, and may elevate the levels of cancer cell migration and proliferation.

CD31;hepatocellular carcinoma;migration;proliferation

R735.7

A

1005-8982（2015）31-0005-05

2015-04-23

廣東省自然科學基金博士啟動項目（No：S2012040007235）

王捷，E-mail：fxd531sgr@126.com