天麻多糖對H22荷瘤小鼠細胞周期及caspase蛋白活性的影響

劉現輝　郭曉娜展俊平　謝忠禮王君明張月藤陳玉龍李曉冰(河南省中醫院，河南　鄭州　45000)

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天麻多糖對H22荷瘤小鼠細胞周期及caspase蛋白活性的影響

劉現輝郭曉娜1展俊平謝忠禮2王君明2張月藤3陳玉龍2李曉冰2
(河南省中醫院，河南鄭州450002)

〔摘要〕目的探討天麻多糖對H22荷瘤小鼠細胞周期及caspase蛋白活性的影響。方法右側腋窩接種H22腫瘤細胞制造荷瘤小鼠模型。實驗設模型組、高劑量天麻多糖組、中劑量天麻多糖組、低劑量天麻多糖組及環磷酰胺(CTX)組。造模后給予天麻多糖或環磷酰胺治療。實驗結束處死小鼠，比較各組瘤重、抑瘤率、caspase-3，8，9及細胞周期分布狀況。結果天麻多糖可明顯減輕瘤重，高劑量天麻多糖抑瘤率可達44. 7%;與模型組比較，天麻多糖中、高劑量組可顯著升高caspase-3，8，9水平及G0/G1期細胞百分數，降低G2/M期細胞百分數。結論天麻多糖對H22荷瘤小鼠具有顯著的抑瘤作用，其作用機制可能與影響細胞周期分布，抑制細胞增殖并激活Caspase系統誘導腫瘤細胞凋亡有關。

〔關鍵詞〕天麻;多糖;腫瘤

1黃河科技學院2河南中醫學院3廣州中醫藥大學

第一作者:劉現輝(1978-)，男，主治醫師，碩士，主要從事免疫藥理學研究。

天麻屬蘭科多年生草本寄生植物，以地下塊莖入藥，具有鎮靜、鎮痛、抗驚厥、降壓、抗炎、抗氧化、延緩衰老等作用〔1〕。天麻中含有天麻素、赤箭苷、胡蘿卜苷、天麻多糖、腺嘌呤、腺嘌呤核苷、多種氨基酸等活性成分〔2〕。目前國內外對天麻化學成分報道較多的是酚類中的天麻素?和多糖類中的天麻多糖，天麻素和天麻多糖也是目前已知的天麻中的主要活性成分。研究表明，天麻多糖具有免疫調節、延緩衰老、降低血壓、抑制病毒和抗抑郁等作用〔3〕。本研究旨在觀察天麻多糖對H22荷瘤小鼠細胞周期及caspase蛋白活性的影響。

1　材料與方法

1. 1實驗動物健康雄性BALB/C小鼠，18～22 g，由河南醫科大學實驗動物中心提供; H22肝癌細胞(H22)株，由中國中醫科學院中藥研究所藥理室提供。

1. 2主要藥物及試劑天麻多糖由西安慧科生物公司提供，批號20120620，純度96. 5%;環磷酰胺(CTX)由上海華聯制藥有限公司生產，批號120706; caspase-3，8，9活性檢測試劑盒購于深圳晶美生物工程有限公司;碘化丙啶(PI)購于上海生工生物技術有限公司。

1. 3動物模型及分組將H22腹水瘤小鼠乳白色濃稠腹水用生理鹽水稀釋至2×106個/ml且活細胞數大于95%，取0. 2 ml接種于健康小鼠右腋皮下。接種后按隨機數字表分為模型組、CTX組、天麻多糖高劑量組、中劑量組及低劑量組。每組12只。

1. 4給藥方法于造模后第2天各實驗組開始用藥。多糖高、中、低劑量組分別按320、160、80 mg/kg天麻多糖灌胃給藥，1次/d，連續14 d; CTX組:按預實驗結果CTX 15 mg·kg－1· d－1灌胃給藥，1次/d，共10 d;模型組灌胃同體積生理鹽水。實驗第15天處死各實驗組小鼠，無菌完整剝離腫瘤組織，用于瘤重稱量、caspase活性測定及細胞周期分析。

1. 5檢測指標與方法

1. 5. 1天麻多糖對H22荷瘤小鼠抑瘤率的影響于造模后第15天處死小鼠，剝離腫瘤組織，用濾紙吸干后稱重。腫瘤抑制率(%)=〔(模型組平均瘤重－治療組平均瘤重)/模型對照組平均瘤重〕×100%〔4〕。

1. 5. 2 caspase-3，8，9活性測定將腫瘤組織置于培養皿中，用手術剪剪碎成3 mm×3 mm左右的小塊，加入冰冷的裂解緩沖液，冰上制備勻漿，勻漿后12 000 r/min離心20 min，取上清液，按照試劑盒操作要求檢測腫瘤組織中caspase-3，8，9活性。

1. 5. 3細胞周期的測定瘤組織剪碎并研磨，采用200目過濾網過濾后制成單細胞懸液并用PBS漂洗，1 000 r/min離心后棄上清細胞重懸于預冷的75%乙醇中，－20℃固定24 h，常規PI染色后，采用流式細胞術檢測細胞周期分布。

1. 6統計學分析實驗結果以x ±s表示，采用SPSS15. 0軟件行單因素方差分析、最小顯著差法檢驗。

2　結果

2. 1天麻多糖對荷瘤鼠抑瘤率的影響與模型組〔(1. 05± 0. 21)g〕相比，各用藥組瘤重明顯減輕，CTX組瘤重〔(0. 43± 0. 11)g〕與模型組相比有極顯著差異(P＜0. 01)，天麻多糖中、高劑量組與模型組相比瘤重減輕〔(0. 62±0. 15)、(0. 48± 0. 09)g〕(P＜0. 05)。低劑量天麻多糖組瘤重(0. 73±0. 16)g。CTX組抑瘤率為59%，高劑量天麻多糖抑瘤率為44. 7%，低、中劑量天麻多糖抑瘤率為20. 9%、31. 4%。

2. 2天麻多糖對荷瘤鼠caspase-3，8，9水平的影響與模型組比較，天麻多糖低劑量組明顯升高casepase-3，8水平(P＜0. 05)，顯著升高caspase-9合成(P＜0. 01);天麻多糖中、高劑量組及CTX組顯著升高caspase-3，8，9水平，與模型組比較有極顯著意義(P＜0. 01)。見表1。

2. 3天麻多糖對荷瘤鼠細胞周期的影響與模型組比較，天麻多糖中、高劑量組G0/G1期細胞百分數增加(P＜0. 05)，而CTX組G0/G1期細胞百分數顯著降低(P＜0. 01)。天麻多糖各劑量組S期細胞的百分數與模型組比較無統計學意義(P＞0. 05)。天麻多糖中、高劑量組G2/M期細胞百分數下降(P＜0. 05)，環磷酰胺組與模型組比較，G2/M期細胞百分數顯著升高(P＜0. 01)。見表2。

表1　天麻多糖對荷瘤鼠caspase-3，8，9水平的影響(x ±s，n=12)

表2　天麻多糖對荷瘤鼠細胞周期的影響(x±s，n=12)

3　討論

本實驗結果表明，天麻多糖可抑制H22移植瘤的生長且呈劑量依賴性。腫瘤細胞的死亡主要通過凋亡和壞死兩個途徑完成，在細胞凋亡過程中，caspase家族的激活起著關鍵作用。按不同caspase家族成員分子結構和激活順序，通常將其分為細胞凋亡的起動因子(caspase-8/-9)和執行分子(caspase-3/-6/-7)。細胞凋亡中最關鍵的步驟是caspase-3的激活〔5〕，其中caspase-8和caspase-9是caspase-3的重要上游激活因子。caspase-8可通過死亡受體途徑激活caspase-3，而caspase-9可通過線粒體途徑活化caspase-3，活化后的caspase-3可誘導腫瘤細胞凋亡〔6，7〕。本文結果發現天麻多糖可顯著升高caspase-3，8，9水平，說明天麻多糖誘導H22肝癌細胞凋亡的機制可能與促使細胞線粒體caspase級聯反應途徑活化有關。

完整的細胞周期包括DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)、有絲分裂期(M期)和休眠期細胞(G0期)。在真核細胞一系列細胞周期檢測點中，G1/S期檢測點至關重要，細胞在該檢測點時對各類生長因子、分裂原以及DNA損傷等復雜的細胞內外信號進行整合和傳遞，決定細胞進行分裂、發生凋亡或進入G0期，許多抗癌藥物都是通過抑制此關鍵點而起調節作用〔8〕。流式細胞儀檢測發現天麻多糖使機體G0/G1期腫瘤細胞百分比增加，G2/M期腫瘤細胞百分比下降，對S期細胞百分比影響不大，表明天麻多糖抑制腫瘤細胞增殖主要是通過阻止腫瘤細胞由G1期進入S期，防止其堿基被復制延緩細胞周期進程，使細胞的增殖速度減慢，達到抑制腫瘤細胞增殖的目的。CTX使G0/G1期和S期細胞百分比下降，G2/M期細胞百分比增加，說明其主要阻止了G2/M期細胞向G1期的轉變。綜上所述，天麻多糖可以抑制H22移植瘤的生長，這可能與天麻多糖阻止腫瘤細胞由G0/G1期進入S期，延緩細胞周期進程及促進腫瘤細胞凋亡有關。

4參考文獻

1沈映君.中藥藥理學〔M〕．北京:人民衛生出版社，2000: 797-801．

2范玉奇，李文蘭，王艷萍，等.天麻化學成分及藥理性質研究的進展〔J〕．藥品評價，2005; 2(4): 309-12.

3陳芳，杜娟，張秉華.天麻多糖的理化性質和藥理活性研究〔J〕．現代中醫藥，2009; 29(6): 71-3.

4 Sun GP，Wang H，Xu SP，et al．Anti-tumor effects of paeonol in a HepA-hepatoma bearing mouse model via induction of tumor cell apoptosis and stimulation of IL-2 and TNF-α production〔J〕．Eur J Pharmacol，2008; 584: 246-52．

5 Clark RS，Kochanek PM，Watkins SC，et al．Caspase-3 mediated neuronal death after traumatic brain injury in rats〔J〕．J Neurochem，2000; 74(2): 740-53.

6 Fan TJ，Han LH，Cong RS，et al．Caspase family proteases and apoptosis 〔J〕．Acta Biochim Biophys Sin，2005; 37(11): 710-27.

7 Zeiss CJ，Neal J，Johnson EA. Caspase -3 in postnatal retinal development and degeneration〔J〕．Invest Ophthamol Vis Sci，2004; 45(3): 964-70．

8 Bartek J，Lukas J. Mammalian G1and S phase checkpoints in response to DNA damage〔J〕．Curr Opin Cell Biol，2001; 13(6): 738-47．

〔2014-09-04修回〕

(編輯郭菁)

The effects of Polysaccharide from Gastrodia Elata B1 on cell cycle and caspase proteins activity in H22 tumor bearing mice

LIU Xian-Hui，GUO Xiao-Na，ZHAN Jun-Ping，et al．
Henan Traditional Chinese Medicine Hospital，Zhengzhou 450002，Henan，China

【Abstract】Objective To observe the effects of Gastrodia Elata B1 Polysaccharide on cell cycle and caspase-3，8，9 activities in H22 tumor bearing mice．Methods Sixty mice were randomly divided into model，CTX，Gastrodia Elata B1 polysaccharide high，middle，low groups．Two weeks later，tumor weight of mice，tumor inhibition rate，caspase 3，8，9 activities and cell cycle were inspected respectively．Results Gastrodia Elata B1 Polysaccharide decreased tumor weight significantly，tumor inhibition rate in Gastrodia Elata B1 polysaccharide high group got 44．7%．Compared with those of model group，polysaccharide in middle and high groups increased caspase-3，8，9 activities and percent of G0/G1phase cells，decreased percent of G2/M phase cells．Conclusions Gastrodia Elata B1 polysaccharide has obvious anti-tumor effect on H22 tumor bearing mice．The mechanism might be related to regulating the cell cycle distribution，inhibiting the cell proliferation and activating the caspase system to induce apoptosis．

【Key words】Gastrodia Elata B1; Polysaccharide; Tumor

通訊作者:李曉冰(1980-)，女，講師，博士，主要從事多糖免疫藥理學研究。

基金項目:國家自然科學基金(No．81173177);中國博士后科學基金(2012M521412);河南中醫學院2010博士基金(BSJJ2010-10)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5681-02;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 001

〔文獻標識碼〕A

〔中圖分類號〕R285. 5